目的基因转化及筛选.docVIP

?第五章(1)目的基因导入受体细胞 ?第一节? 受体细胞? 外源基因与载体在体外连接重组后形成重组DNA分子，该重组分子必须导入适宜的细胞中方能使外源基因得以大量扩增或表达。在基因工程飞速发展的今天，原核细胞和真核细胞都可以作为基因工程的受体细胞，选择适宜的受体细胞也已成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一。 受体细胞（receptor cell）又称宿主细胞（host cell），从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。显然，并不是所有的细胞都可用作受体细胞。一般来说，受体细胞的选择就符合以下基本条件： ①便于重组DNA分子的导入。 ②能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。 ③便于重组体的筛选。④遗传稳定性高，便于扩大培养或发酵生产。对动物细胞而言，受体细胞应对培养条件有较强的适应性，可以在无血清培养基中进行贴壁或悬浮培养。 ⑤安全性高，无致病性，不会对环境造成污染。 ⑥具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。 ⑦在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。 ⑧选用内湖内源性蛋白酶基因缺失的细胞或蛋白酶含量低的细胞。 在实际应用中，可根据需要重点考虑其中的部分要求。基因工程中常用的受体细胞如下: 一、原核生物细胞 原核细胞是较为理想的受体细胞类型，这是因为：①大部分的原核细胞没有纤维素组成的细胞壁，便于外源DNA分子的进入；②没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体重组减少了麻烦；③基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；④原核生物多数为单核细胞生物，培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。因此，原核细胞广泛作为基因工程的受体细胞。 但是，经原核生物细胞来表达真核生物基因也存在一定的缺陷，许多真核基因不能在原核细胞如大肠杆菌中表达出有生物活性的功能蛋白质。原因是：①原核生物细胞不具备真核生物细胞的蛋白质折叠复性系统，表达出蛋白产物往往是无特异性空间结构的多肽链；②原核细胞缺乏真核细胞的蛋白质加工修饰系统，不能进行多肽的糖基化、磷酸化等；③原核细胞内的蛋白酶易降解空间构型不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定。这些缺陷制约了原核细胞作为生物反应器进行异源真核蛋白的大规模生产。 ??? 至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。 1．大肠杆菌作为受体菌 大肠杆菌是基因工程中发展最为完善和成熟的载体受体系统。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，一些菌株的染色体DNA已经测序完毕，大部分基因的功能已被鉴定。目前已经实现商品化的多种基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌工程菌生产的，如人胰岛素、生长素、干扰素等。但是，大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。 2.枯草杆菌作为受体菌 又称为枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性杆菌，作为基因工程受体菌的最大优点是除具有大肠杆菌的优点外，还具有：①枯草杆菌具有胞外酶分泌-调节基因，能将表达产物高效分泌到培养基中，大大简化了表达产物的提取和架式处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白在分泌后便具有了天然构象和生物活性。②不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。③具有芽孢形成能力，易于保存和培养。 现已成功地利用枯草杆菌表达了人的b-干扰素、白细胞介素、乙肝病毒核心抗原等。 3．蓝细菌作为受体菌 蓝细菌，也称为蓝藻，作为基因工程受体细胞的最大优点是：①蓝藻是一类光能自养微生物，培养简便，营养条件要求低，可用于大规模生产。②由于密码子的偏向性和启动子的通用性，某些蓝藻可能成为植物基因表达的宿主。 二、真菌细胞 ??? 真菌是低等真核生物。在基因工程中常用的真菌受体细胞有酵母菌细胞等。 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核微生物，分属于子囊菌纲（子囊菌酵母）、担子菌纲（担子菌酵母）和半知菌类（半知菌酵母），共由56个属和500多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因表达最成熟的原核生物系统，则酵母菌是外源基因最理想的真核生物表达系统。作为一个真核生物表达系统，酵母菌的优势是：（1）基因表达调控机理比较清楚，并且遗传操作相对较为简单；（2）具有原核细菌无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；（3）不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属（如酿酒酵母等）在食品工业中有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统；（4）大规模发酵工艺简单，成本低廉；（5）能将外源基因表达产物分泌至培养基中；（6）酵母菌是最简单的真核生物，利用酵母菌表达动植物基因能在相当大的程度上阐明高等真核生物乃至人类基因表达调控的基本原理以及基因编码产物结构与功能之间的关系。因此，酵母菌的基因工程具有极为重要的经济意义和学术价值。 三、植