第三节 细胞生物学研究方法课件.ppt

?????????????????????????????? 荧光共振能量转移技术 供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，当两分子距离10nm时，发生非放射性的能量转移，即FRET现象，使供体荧光减弱（猝灭），而受体荧光增强。用以检测活体中生物大分子纳米级距离及其变化，分析生物大分子间相互作用、细胞生理研究、免疫分析等。 ? （fluorescence resonance energy transfer, FRET) 真核生长转录因子GAL4具有DNA结合功能域（DNA binding domain,DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD），它们空间距离大时不激活转录，近时激活基因转录。 　将含BD基因+诱饵蛋白Bait protein基因的载体和含AD基因+靶蛋白基因表达载体转化到改造后的酵母中，如蛋白间能够相互作用，GAL4激活酵母的报告基因表达。 酵母双杂交技术 （四 ） 细胞培养 细胞培养：即将动、植物组织或细胞从机体取出，分散成单细胞或直接以单细胞生物给予必要生长条件，使其在培养瓶中或培养基上继续生长与繁殖。 应用：疫苗生产、药物研制、肿瘤防治、植物育种、基础理论的研究等。 动物细胞培养 植物细胞培养 非细胞体系在细胞生物学研究中的应用 思 考 题 1．从光源、透镜和成像3方面比较电镜和光镜。 2．说明对不同细胞、细胞不同组分进行分级分离所用方法的基本原理。 3．举例说明电子显微技术与细胞分子生物学技术的结合在当代细胞生物学研究中的应用。 2）透射电镜制样技术 取材—— 漂洗 ——固定（ 前固定，后固定）————脱水（乙醇）——浸透——包埋——制备超薄切片——电子染色——观察 常规制样技术 包埋 染色 清洗\脱水 ①超薄切片技术 ② 负染技术 阴性反差染色，染色剂并不被样品吸收，而是沉淀到样品四周而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，用于细菌、病毒、噬菌体和亚细胞结构、蛋白晶体检测。分辨力可达1.5nm左右。 肌动蛋白纤维的负染 病毒的荚膜观察（左为负染） ③冰冻断裂和冷冻蚀刻技术 步骤 快速冷冻 低温断裂 蚀刻 复型 2 扫描电子显微镜 (Scanning electron microscope，SEM) 光源也为电子束,其经电磁透镜被汇聚成极细的“电子探针”，由一组扫描发生器(偏转线圈)控制，在样品表面进行栅状扫描； 样品受电子轰击后产生二次电子，其多少与样品表面的立体形貌有关，故在荧光屏上得到一幅立体图像。 分辨率～6 nm，景深大； 观察细胞或细胞群体复杂精细的立体形貌。 扫描电镜常规制样技术 取材——固定——漂洗——脱水（乙醇）——用醋酸异戊酯置换乙醇——二氧化碳临界点干燥——粘贴样品——离子溅射镀膜——观察 酵母 电子显微镜与光学显微镜的基本区别 样品对电子的散射所形成的明暗差（肉眼不可见） 样品对光吸收所形成的明暗差和颜色差（肉眼可见） 成像原理 要求真空 不要求真空 真 空 电磁透镜 玻璃透镜 透 镜 0.1nm 200nm 分辨本领 电子束（波长为0.01-0.9nm) 可见光（波长为400-700nm) 光 源 电 镜 光 镜 聚光镜 中间像 物镜 目镜 光源 光镜和电镜的光路系统比较 （三） 细胞及其组分的分离和纯化 用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等显示方法 特异蛋白的抗原的定位与定性 细胞内特异核酸序列的定位与定性 利用放射性标记技术研究生物大分子在细胞内的合成 动态 定量细胞化学分析技术 1 用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 1）差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 2）密度梯度离心：将要分离的细胞组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的、形成密度梯度的、高溶解度的、惰性物质（如蔗糖）溶液的表面，然后离心，不同的组分将以不同的沉降速率沉降，形成不同的沉降带。 差速离心结合密度梯度离心分离细胞组分示意图 2 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等显示方法 利用一些显色剂能与胞内一些特殊基团进行特异性结合的特征，判断某种物质在细胞内的分布及含量。 如： Feulgen反应 D NA（紫红色） PAS反应 多糖（紫红色） Millon反应