应激影响细胞活力的机制探讨.ppt

today Giemsa staining 1. PBS洗涤1次，3min/次 2. Giemsa染色10 min 3. 水洗1到2次，直至背景干净 4.夹取小玻片放置于干燥载玻片上，镜下观察 Hoechst33258 staining 1.PBS洗涤2次，3min/次 2.Hoechst 33258 染色(25ul) 30 min (置于抽屉中，避光) 3.PBS洗涤3次，5min/次(避光)，最后一次PBS不弃掉 4.拍照 ATTN:除Hoechst33258用移液器外加入25ul外， 其他步骤（PBS，甲醇，Giemsa）均用吸管加入液体（覆盖住底面即可），用移液器吸弃废液。 要 求 实验四 根据结果进行分析，希望思考进一步应进行的指标检测 Many assays exist to measure apoptosis Cells undergoing apoptosis show characteristic morphological and biochemical features. So today we will observe the morphological change of apoptosis. * * A mixture of different dye. the condensed chromatin in apoptotic cells more brightly than the chromatin in normal cells. 细胞与遗传实验 细胞实验三 5组细胞给予不同处理 正常、缺糖损伤、药物处理 细胞活力的结果 细胞活力改变的可能原因 实验内容 1.不同的实验分组相同 对照组（Control） ---正常培养的细胞 无糖损伤组（Glucose deprivation，GD） ---给予对数生长期细胞无糖培养约24小时 顺铂20umol/l处理组（DDP 20umol/l ） ---对数生长期细胞给予顺铂20umol/l处理24小时 顺铂40umol/l处理组（DDP 40umol/l ） ---对数生长期细胞给予顺铂40umol/l处理24小时 顺铂60umol/l处理组（DDP 60umol/l ） ---对数生长期细胞给予顺铂60umol/l处理24小时 实验内容 2.检测指标 （2）Giemsa染色 （3）Hoechst 33258染色 Apoptosis assay Many assays exist to measure apoptosis. Detection of apopotosis cell morphology by fluorescence /light microscope /electron microscope Gel electrophoresis for DNA ladder Tunel (cytochemical method for detect DNA fragmentation) Annexin Ⅴ/PI assay …… electron microscope TEM SEM 细胞凋亡透射电镜下形态（bar=2μm） Control Grp75 Overexpression Normal Normal GD 12h GD 24h Annexin V/PI Annexin Ⅴ 分子量为35-36kD Ca2+依赖性磷脂结合蛋白 与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）高亲和力特异性结合。 以标记了FITC或EGFP的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。 Annexin Ⅴ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。 AnnexinV/PI 双染法检测细胞凋亡 左下象限：正常细胞；右下象限：早期凋亡细胞； 右上象限：晚期凋亡细胞；左上象限：坏死细胞 DNA ladder TUNEL 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxy