蛋白质组学的核心技术——质谱.ppt

Putative isoflavone synthase 例2. 兔肌浆网膜蛋白质组学研究——Shotgun Proteomics 差速离心、蔗糖密度梯度离心： 11,500 g 20min 2次 21，000g 1h KCl抽提：110，000g 45min 27%-45%蔗糖密度梯度：70,000 g 16h 轻膜：32%与 38%之间的界面层 重膜：38%与 45%之间的界面层 110,000 g 1h 兔肌浆网膜SR的蛋白质组学研究——Shotgun Proteomics LTQ-Orbitrap Velos 轨道阱质谱仪 SorcererTM-SEQUEST（version4.1.4 build， Sage-N Research， Inc.）搜素引擎 NCBI Refseq 中家兔蛋白质序列数据库 鉴定到678 种蛋白质 1D-SDS——酶切——LC-MS-MS 重膜 轻膜 兔肌浆网膜SR的蛋白质组学研究——Shotgun Proteomics * 参考文献：Cardiac sarcoplasmic reticulum and sarcolemmal proteins separated by two-dimensional eletrophoresis： surfactant effects on membrane solubilization . Electrophoresis 2000,21,1685-1693 1. 溶解：SR（重膜/轻膜） +9倍体积的4%SDS，混合至澄清 2. 沉淀：+9倍体积的丙酮。4℃，沉淀2h 3. 4℃，12000rpm，90min 4. 弃上清，沉淀于4℃空气干燥。 -80℃冻存。 重膜的上样量为720μg，轻膜的上样量为315μg， pH3-10，在4-12%的梯度胶中分离。 * KCl抽提：去除一些通过静电相互作用与SSR 相连的可溶性蛋白 * KCl抽提：去除一些通过静电相互作用与SSR 相连的可溶性蛋白 * KCl抽提：去除一些通过静电相互作用与SSR 相连的可溶性蛋白 蛋白质组学与质谱 1. 蛋白质组学导论 2. 蛋白质组学中的应用 3. 蛋白质组学的新方向 4. 蛋白质组学的技术 5.蛋白质组学的核心技术——质谱 6. 应用实例 获奖原因 芬恩和田中的贡献：开发出对生物大分子进行质谱分析的“软解吸附作用电离法” 通过对蛋白质进行详细的分析而加深对生命进程的了解 使新药的开发发生了革命性的变化 在食品控制、乳腺癌和前列腺癌的早期诊断等其他领域也得到了广泛的应用 质谱分析技术 MS/MS detection of the WAILGLGVR peptide MALDI-TOF-MS 仪器 MALDI-TOF-MS示意图 MALDI-TOF-MS 工作原理 样品与基质（2,5-二羟基苯甲酸，芥子酸，烟酸，a-氰基-4-羟基肉桂酸等）在芯片共结晶 放入真空管 , 激光照射，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，将质子从基质转移到生物分子，或者从生物分子转移到基质，生物分子电离，产生的多为单电荷离子 在加速电场中获得相同的动能，在漂移区内按照质荷比率分离，在真空小管中飞行到达检测器 常用TOF检测器，离子质量越小，就越快到达 肽质量指纹图谱 （Peptide Mass Fingerprint，PMF） AB Sciex QTRAP 5500-Agilent 1290 LC (LC/MS/MS system) 电喷雾电离（ESI）示意图 电喷雾电离（ESI）的原理 (a) MS/MS detection of the WAILGLGVR. (b) RP LC-MS/MS base peak chromatogram of a selected SCX fraction. (c) SCX chromatogram showing fractionation of microsomal membrane proteins isolated from murine NK cells 蛋白质组学与质谱 1. 蛋白质组学导论 2. 蛋白质组学中的应用 3. 蛋白质组学的新方向 4. 蛋白质组学的技术 5. 蛋白质组学的核心技术——质谱 6. 应用实例 例1. PMF鉴定原核细胞表达的异黄酮合酶IFS 构建表达质粒载体 SDSTrypsin 酶切 MALDI-TOF 质谱分析 MS-Fit search