SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）.ppt

丽春红染色 1. 转膜结束后，取下转膜装置，打开夹板，小心用镊子取出尼龙膜，蛋白面朝上置于10ml 1×的丽春红染液中，摇床上染色10min左右 2. 蛋白面朝上，用去离子水洗3-4次，至红色基本褪去后，拍照。 3. 再用去离子水洗膜至红色完全褪去 封闭 取出两块膜，用滤纸将残留液体吸净后，将两块膜的蛋白面相对放入封闭液 2.??RT，1-2hours 或 4℃过夜 一抗 1 把膜从冰箱中取出，RT ，30min。 注： 封闭液可回收 四个角蘸点水铺好保鲜膜后，加1：100的一抗500ul（抗体稀释液495ul+5ul mouse p65抗体）于保鲜膜上 蛋白面朝下，使尼龙膜和一抗充分接触。注避免产生气泡，如有气泡，可用镊子将膜的四角轻轻提起，排出气泡 盖上玻璃平皿，RT下孵育2hours TBST 10min×2 ； TBS 10min×1 二 抗 1.同上铺好保鲜膜，加1：1000 的二抗1000ul（1ul mouse 抗人IgG-HRP+ 999ul抗体稀释液） 2.同上蛋白面朝下放好尼龙膜，要避免产生气泡 3.?盖上平皿，同上RT孵育2 hours 4.?TBST 10min ×2 ； TBS 10min×1 显 色 1 铺好保鲜膜，分别滴加5滴发光试剂A和B，混合1min 2??同上蛋白面朝下放好尼龙膜，要避免产生气泡。反应1min 3?? 用镊子夹起尼龙膜，用滤纸将多余的发光试剂吸尽，至没有液体滴下为止 4 将尼龙膜蛋白面朝上置于另外两块铺好的保鲜膜上。用滤纸将膜边的残余液体吸净后，折回保鲜膜，将之放到压膜用的夹板里 转膜 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转移 滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致 以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜5min 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极 排去滤纸、胶和膜间的气泡 电转时间：200mA 1-2h,转移结束后，膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置 （3）封闭 5％脱脂奶粉或3％BSA （含0.1％Tween20 TBS或PBS配制） 时间：室温3h或4oC 过夜 封闭液回收 显色 辣根过氧化物酶：底物为DAB 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT 化学发光显影 最常用,辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） 注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定 膜的再利用 1.化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping Buffer洗涤后（洗涤Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的? －2ME ）用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3－4次 2.碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交 * Thank you! SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 一. 实验目的 1.学习SDS测定蛋白质分子量的原理 2.掌握垂直板电泳的操作方法 3.熟悉蛋白印迹技术原理和方法 二. 实验原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠） 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？ SDS的作用 SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小 当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =－b ? m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数 因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和