实时荧光定量PCR(qPCR,RT_PCR)的原理和应用.ppt

2013-11-26 实时荧光定量PCR技术的原理及应用（Real Time Quantitative PCR） Contents 实时荧光定量PCR目录 实时荧光定量PCR的定义 普通 PCR 在PCR结束后对 进行定量分析 终点产物 PCR技术和荧光检测技术的结合 通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。 克服了普通PCR：1、终点定量重复性不好 2、EB有毒，荧光太贵等缺点 实时荧光定量PCR的定义 PCR技术和荧光检测技术的结合 通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。 实时荧光定量PCR的定义 ？ 为什么选择对初始模板定量 而不是终产物定量 RT-PCR技术的原理及试验流程  RT-PCR技术的原理及试验流程  RT-PCR反应体系 模板 4.5μl Tag mixture 5.0μl F(F’) 0.25μl R(R’) 0.25μl 荧光染料 SYBR Green I 荧光标记的探针TaqMan探针法 RT-PCR技术的原理及试验流程  Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法） 变性 退火 延伸 RT-PCR技术的原理及试验流程  SYBR Green法优缺点 RT-PCR技术的原理及试验流程  RT-PCR技术的原理及试验流程  Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法） RT-PCR技术的原理及试验流程  TaqMan法 TaqMan探针法优缺点 RT-PCR技术的原理及试验流程  •绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究 RT-PCR技术的数据分析 相对定量通过内标定量 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 RT-PCR技术的数据分析 内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 PCR分四个阶段 RT-PCR技术的数据分析 如何定量？ RT-PCR技术的数据分析 -ΔΔCt PCR扩增循环数 扣除背景荧光后的相对荧光量 1. 荧光域值（threshold）的设定 在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到，一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。      如何定量？ RT-PCR技术的数据分析 -ΔΔCt PCR扩增循环数 扣除背景荧光后的相对荧光量 2. Ct 值的定义      在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图所示）。 如何定量？ RT-PCR技术的数据分析 -ΔΔCt 3. Ct值与起始模板的关系     研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。      PCR扩增循环数 扣除背景荧光后的相对荧光量 RT-PCR技术的数据分析 3. Ct值与起始模板的关系     研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。      RT-PCR技术的数据分析 相对定量分析方法 -ΔΔCt 前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值： ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test)