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重组生产胶原蛋白的研究进展 论文导读：而且细胞培养过程中的费用是其他细胞类型（如酵母和大肠杆菌）发酵培养过程花费的5-10倍。所以需要克隆和表达人源胃蛋白酶用于毕赤酵母商业生产重组胶原蛋白。 关键词：重组胶原蛋白，酵母，转基因动物和植物，脯氨酰羟化酶 原胶原链在翻译后立刻运输到内质网内腔被P4H羟基化，每条a 链大约有100个脯氨酸发生羟基化作用，每个发生羟基化的脯氨酸出现在GlyXY的Y位置。论文大全。例如, 在I型人源胶原蛋白中，羟基脯氨酸与脯氨酸总数的比率大约是0.46 　　[3] 　　 。如果缺乏羟基化的脯氨酸, 在生理温度下，胶原蛋白基本的螺旋构象是热不 稳定的 　　[4] 　　。所以生产热稳定性的重组胶原蛋白需要高水平的表达胶原蛋白并且有足够的P4H活性来催化其 羟基化。 重组胶原蛋白已经在哺乳动物细胞 　　[510] 　　、昆虫细胞 　　[1115] 　　、酵母 　　[1621] 　　、大肠杆菌 　　[22] 　　、 转基因烟草 　　[2326] 　　、小鼠 　　[27,28] 　　和蚕 　　[29] 　　中得到表达。在各种重组表达系统中，只有哺乳动物细胞在转染胶原蛋白基因而不转染P4H基因的情况下，可以表达充分羟基化的胶原蛋白 　　[1115] 　　。胶原蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平从0.6到20 mg/l不等，在昆虫细胞中最高可以达到40 mg/l 。然而, 这种表达水平对大规模的商业化生产来说太低，而且细胞培养过程中的费用是其他细胞类型（如酵母和大肠杆菌）发酵培养过程花费的5-10倍。而在其它的重组表达系统中, 遇到的一个普遍问题是宿主细胞不能提供足够的P4H活性来充分羟基化胶原蛋白。一种多基因表达技术已经用来共表达胶原蛋白和P4H，并且已有利用多基因表达技术以毕赤酵母为宿主细胞表达胶原蛋白的报道。 2.2在酵母中的表达 2.2.1 在酵母中的表达 重组IIV, VII, IX, XIII,XV和 XVIII型胶原蛋白已经在毕赤酵母中与P4H得到共表达 　　[1920] 　　。在商业化生产中，初期III型胶原在毕赤酵母中的表达水平是15 mg/l 　　 [19] 　　。论文大全。通过遗传干涉、发酵条件优化、工艺过程开发等方面的研究，现在某些胶原蛋白类型的收率已超过1 g/l。毕赤酵母中表达的胶原并不分泌到细胞外基质而是在细胞内积聚 [1921,30] 　　，故需要从细胞中提取胶原前体，通过蛋白酶处理转化为胶原蛋白。哺乳动物细胞中, 特异的细胞外金属蛋白酶催化去除胶原前体N-和C-前肽 　　[31] 　　，从组织中分离的前胶原通常利用非特异性的蛋白酶如胃蛋白酶来催化完成这种反应。现在生产中应用的都是动物来源的胃蛋白酶，同样会带来动物来源材料的各种弊端，所以需要克隆和表达人源胃蛋白酶用于毕赤酵母商业生产重组胶原蛋白。 毕赤酵母采用在确定化学成分的基础培养基中，分批补料和空气补氧搅拌的模式进行发酵，并以甲醇诱导表达，可以得到很高的菌体密度 (500 g/l 湿菌重)[32]。重组胶原和P4H基因在乙醇氧化酶启动子的控制下进行表达，所以当生物量积累到一定量后，加甲醇以诱导表达。当菌体密度和前胶原都积累到最大量时，停止发酵，从培养基中收集菌体，并以物理方法打碎得到胶原前体，再通过重组人源胃蛋白酶的处理，胶原前体转化为胶原蛋白。通过沉降或过滤的方法将重组胶原蛋白与细胞碎片分离，其他的纯化步骤用来除去可溶性的杂质，最后得到的产物是溶解于0.01 M HCl 中高纯度无菌的重组胶原蛋白。 2.2.2 酵母中重组胶原蛋白的特性 大多数毕赤酵母中表达的重组胶原蛋白是以单体形式存在的，某些蛋白类型中约510% 共价交联成二聚体，在III型胶原蛋白中还有很少一部分以三聚体形式存在，这是重组胶原蛋白与动物来源胶原蛋白的一个很重要的差别。天然胶原蛋白很大比例以二聚体、三聚体和其他高分子量聚体的形式存在，例如从牛皮中提取的I 型胶原蛋白大约54%是以聚体形式存在的。这样毕赤酵母表达的胶原蛋白就有着更好的匀质性。 毕赤酵母表达的I型和III型胶原蛋白中羟基脯氨酸与脯氨酸的比率分别是0.47和 0.56。数值与组织中获取的很接近，说明共表达的P4H已经将表达的胶原蛋白充分羟基化 　　[33] 　　。毕赤酵母表达的I型和牛源I型胶原蛋白溶解温度分别是40.5和42.6℃，非常相近。酵母中表达纯化的胶原蛋白在中性pH的磷酸盐缓冲液中可自发的形成胶原纤维结构，其结构与组织中提取的胶原蛋白形成的纤维结构非常接近。 2.3 转基因系统表达重组胶原蛋白 3个转基因系统烟草、小鼠和蚕已经作为有潜力的大规模、低成本生产重组蛋白的系统开发。在过去的