转基因检测国家局培训教材(基因成分检测).ppt

A.方法简介 普通PCR+电泳方法 原理 聚合酶链式反应（PCR）在反应缓冲液中，脱氧核糖核酸、寡核苷酸引物在DNA聚合酶的作用下经循环反应对目标序列进行复制。 PCR产物可用琼脂糖凝胶电泳方法依据DNA分子长度的不同加以分离。 A.方法简介 缺点： 1. 普通PCR灵敏度可达到0.1％，而实时荧光PCR检测下限可达到0.01％。 2. 电泳存在EB等致癌物质，需要特殊处理。 3. 检测时间长。 B.检测目标物 1　物种特异性检测方法 大豆、番茄、玉米、油菜、马铃薯、棉属作物、真核生物18SrRNA、叶绿体多拷贝DNA序列检测方法。 2　筛选检测方法： CaMV35S启动子、 NOS终止子、 NPTII基因、FMV 35S启动子筛选检测方法。 3　结构基因特异性检测方法 抗草甘膦大豆、转基因番茄Zeneca?、转基因玉米Bt11、Bt176、T25、转基因马铃薯New Leaf? Plus、New Leaf? Y结构基因特异性检测方法。 4　品系特异性检测方法 转基因玉米MON810、抗草甘膦油菜RT73品系特异性检测方法、棉花MON531、华番一号。 C.检测体系 D.结果判定 PCR 检测时应做平行对照，两份平行样品结果应保持一致。如果一个样品结果为阳性而另一个为阴性时，应重新进行检测。可以通过增加PCR反应中DNA的模板量使两份平行样结果一致。 所检测目标片段出现扩增，且PCR产物经过确认，所有对照结果正常，结果判定为阳性，所检测目标片段未出现扩增; 所有对照结果正常，结果判定为阴性。 一般要求 实验结果不能用“+/－”来表述。 阴性结果不能用“不含GMO”（“GMO not present”）来表述。 E.结果表述 阴性结果的表述 测试报告应该包括下列内容： “对于X物种，未检测出转基因成分。 根据xxx（即标准参照物质），该方法的检测下限为X %。” 英文表述为： “For species X, GMO derived material was not detected. The LOD of the method is X % determined with xxx (identify the reference material).” 测试报告应该包括下列内容： “对于X物种，检测出转基因成分。” 英文表述为： “For species X, the presence of GMO derived material was detected.” 阳性结果的表述 3. 核酸定量PCR检测方法 使用标准方法 GB/T 19495.5-2004 转基因产品检测?? 核酸定量PCR检测方法 本标准方法规定了转基因成分核酸定量检测方法，适用于种子、饲料、食品和环境样品中转基因成分的实时荧光PCR定量检测。从以下五个方面进行介绍： 主要内容 A.方法原理简介 B.检测目标物 C.检测体系 D.定量计算 E.结果表述 实时荧光PCR方法：在普通PCR基础上引入标记有荧光基团的寡核苷酸探针，可与目的片段结合，在DNA聚合酶的作用下寡核苷酸降解，荧光释放出来。荧光的积累与PCR产物的形成同步，荧光的强度反映了产物生成的量。 通过设置标准物质/分子，绘制出标准曲线，进而可对样品中的目标分子进行定量判断。 优点：1.快速 2.灵敏 3.污染小 A.方法原理简介 实时荧光PCR的原理 R = Reporter FAM? or VIC? Dyes Q = Quencher TAMRA? Dye R Q 扩增曲线：域值和Ct值 Sample No Template Threshold Baseline Rn+ Rn- Ct EVENT176玉米中CryIA(b)标准曲线 B.检测目标物 转基因大豆GTS-40-3-2； 转基因玉米MON810、Bt176、Bt11及GA21； 转基因油菜RT73。 试剂名称 终浓度 10×PCR反应缓冲液 1× MgCl2 2.5 mmol/L dNTPs (含dUTP) 0.2 mmol/L UNG酶*** 0.075 U 引物 (上游) 0.2 ?mol/L 引物 (下游) 0.2 ?mol/L 探针 0.1 ?mol/L Taq酶*** 2.5 U DNA模板 (20 ng~30 ng/?L) 5 ?L 补水至 50 ?L *DNA模板可视加工程度适当增加模板量。 C.检测体系 转基因产品含量（%）＝ 测试样品中外源基因的