猪流行性腹泻病毒PCR检测及其M基因的遗传变异分析.PDF

动物医学进展 ，2013，34(8)：13—18 ProgressinVeterinaryM edicine 猪流行性腹泻病毒 PCR检测及其 M 基因的遗传变异分析 张 志 ，李 岚 ，董雅琴 ，王赛赛。，刘 爽 ，吴发兴 ，李晓成¨ (1．中国动物卫生与流行病学 中心，山东青岛 266032；2．云南农业大学 ，云南昆明650201；3．福建农林大学 ，福建福州 350002) 摘 要：为了解我 国猪流行性腹泻病毒 (PEDV)的流行情况，利用套式反转录一聚合酶链反应 (nRT— PCR)技术 ，从表现腹泻症状的仔猪粪便 中扩增 出6份 阳性样品，测序表明，一扩 PCR产物的大小为854bp， 涵盖 PEDV的M基 因。选择 34个参考毒株基于 M基 因进行进化树分析，结果显示 PEDV可以分为 G1和 G2两个基 因型 7个基因亚型。G1型以2007年前的经典毒株为主，包括 CV777、Brl／87、KPEDV一9、JMe2 和 CH／S株等；G2型则以近年分离的毒株为主，包括 GDXS5、JS一2004—2、PFF188、KU06RB08等。其 中 G2．3亚型 已经成为 目前世界上主要的PEDV流行毒株，包括本次检测的6株 PEDV、泰 国的KUO6RB08及 GenBank中我 国和韩国20l1年的流行毒株 。通过 同源性比较发现，这 6株 PEDV之间的同源性为 98．2 ～ 100 ，与经典毒株 CV777的同源性为 97．6 ～98．2 。结果表明，尽管 PEDV之 间的同源性仍较 高，但 PEDV流行毒株 已经逐渐形成独特的流行进化分支。 关键词 ：猪流行性腹泻病毒；M 基因；进化分析 中国分类号 ：$852．65 文献标识码 ：A 文章编号 ：1007—5O38(2O13)08—0013—06 猪流行 性腹 泻 (Porcineepidemicdiarrhea， 集了河南某猪场 的粪便样 品，进行 了PEDV 的检 PED)是由猪流行性腹泻病毒 (Porcineepidemicdi— 测 ，结果分离到了PEDV，分析其基 因演化 ，表 明为 arrheavirus，PEDV)引起的猪的一种高度接触性传 韩国、泰国等国家正在流行的进化分支，为进一步防 染病 ，该病以猪水样腹泻 、呕吐和脱水为特征 ，各年 控该病提供了技术支持 。 龄猪和不同品种的猪群都有易感性，但对哺乳仔猪 1 材料与方法 的危害性较大。1971年 ，英 国首先报道 了 PED 的 1．1 材料 发生r1]，随后，比利时、德 国、瑞士、日本等许多国家 1．1．1 样品 6份粪便样品，采 自河南某规模猪场 相继报道 了该病 的发生_2]。我国在 1976年首次报 出现腹泻的2日龄～7日龄仔猪 ，该场 2011年 5月 道猪流行性腹泻的发生 ，但直到 1984年才通过免疫 份产下 2000多头仔猪 ，发病猪在产后 1d～2d表 荧光试验证实病原为 PEDV ]。20世纪 8O年代 以 现腹泻、黄 白色水样粪便 ，常常在 2d～3d内死亡。 后 ，我国不断有 PED发生的报道 ，26个省市 自治区 发病率 9O％，病死率 75％，收集仔猪粪便样 品置青 都曾发生过。2O世纪 90年代后期 ，我 国开始大面 霉素瓶 中冻存。 积地使用猪传染性 胃肠炎和猪流行性腹泻二联疫苗 1．1．2 主要试剂 RNA 的提取试剂 Trizol为 In— 进行免疫 ，取得 了很好 的效果l4]。但从 2006年 以 vitrogen公司产 品；反转 录酶 AMV、Taq酶等为 后 ，在一些免疫过 PEDV疫苗 的猪场多次发生腹泻 Takara公司产品；乙醇 、异丙醇 、氯仿等试剂均为分 疫情 。尤其是 2011年冬末 2012年春季之 际，我国 析纯产品。 广东、福建等南方数省持续暴发仔猪腹泻 。2012年 1．2 方法 3月～5月份 ，河南 、辽宁等北方省份 的猪群也不 同 1．2．1 猪粪便样 品的处理和病毒 RNA提取 每 程度地暴发了仔猪腹泻 ，个别猪场仔猪 的感染率高 份粪便按照 1：5的比例加入 PBS缓冲液 ，4℃ 达 9O％以上 ，病死率超过了 5O ，给养猪业造成 了 5