杉木实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择-林业科学研究.PDF

林业科学研究　２０１９，３２（２）：６５ ７２ ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ 　　ＤＯＩ：１０．１３２７５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｌｙｋｘｙｊ．２０１９．０２．０１０ 杉木实时荧光定量ＰＣＲ分析中内参基因的选择 １ １ １ １，２ １，２ 张　颖 ，陈婉婷 ，陈冉红 ，帅　鹏 ，李　明 （１．福建农林大学林学院，福建 福州　３５０００２；２．国家林业和草原局杉木工程技术研究中心，福建 福州　３５０００２） 摘要：［目的］筛选适用于杉木不同组织荧光定量ＰＣＲ分析的稳定内参基因，提高杉木实时荧光定量ＰＣＲ试验 准确性，为杉木体内各个基因表达分析提供合适内参基因。［方法］通过实时荧光定量ＰＣＲ获取 ＧＡＰＤＨ、ＥＦ１、 α １８ＳｒＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡ、ＵＢＱ、ＵＢＣ与Ａｃｔｉｎ７个候选内参基因在杉木无性系的根、茎和叶中的溶解曲线与Ｃｔ值；利 用软件ｇｅＮｏｒｍ、Ｎｏｒｍｆｉｎｄｅｒ和ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ对候选内参基因的表达稳定性进行评价；通过分析２个纤维素合酶基因 ＣｌＣｅｓＡ１和ＣｌＣｅｓＡ２在杉木不同组织部位的相对表达情况，对候选内参基因的稳定性进行验证。［结果］ｇｅＮｏｒｍ、 Ｎｏｒｍｆｉｎｄｅｒ和ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ分析结果均表明：在杉木根和茎中最稳定的内参基因是ＥＦ１ 和Ａｃｔｉｎ；ｇｅＮｏｒｍ、Ｎｏｒｍ α ｆｉｎｄｅｒ结果显示杉木叶中稳定的内参基因是 ＵＢＱ和ＥＦ１，ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ显示杉木叶中最稳定合适内参基因是 α ＥＦ１ 和Ａｃｔｉｎ。以Ａｃｔｉｎ与ＥＦ１作为内参基因，荧光定量ＰＣＲ分析表明，ＣｌＣｅｓＡ１和ＣｌＣｅｓＡ２基因的相对表达量 α α 在杉木不同组织中均有所不同，ＣｌＣｅｓＡ２的相对表达量在各个组织中均高于ＣｌＣｅｓＡ１。以不同内参基因作为试验 内参基因分析ＣｌＣｅｓＡ１和ＣｌＣｅｓＡ２的表达情况得到，ＣｌＣｅｓＡ１和ＣｌＣｅｓＡ２在各个组织中的相对表达量排序主要为 茎 ＞叶 ＞根。［结论］７个候选内参基因中，杉木不同组织中稳定表达的为Ａｃｔｉｎ与ＥＦ１，适合作为表达分析 α 的内参基因；２８ＳｒＲＮＡ的表达稳定性低，不适合作为杉木定量ＰＣＲ分析的理想内参基因。 关键词：杉木；荧光定量；内参基因；ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ 中图分类号：Ｓ７１８．４６ 文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００１１４９８（２０１９）０２００６５０８ 　　 实时荧光定量 ＰＣＲ（ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲｅａｌｔｉｍｅ 产、材质优良等特点，在我国南方地区有广泛的栽培 ＰＣＲ）是一种高精度、高通量地检测目的基因表达水 和利用。随着分子生物学的发展，目前针对杉木的 平的稳定方法，在现代分子生物学研究中的应用十 转录组测序、基因克隆和ｍｉｃｒｏＲＮＡ功能研究越来越 分广泛。但是，实时荧光定量 ＰＣＲ实验很容易受 多，这些研究涉及到使用荧光定量ＰＣＲ技术检测目 ＲＮＡ质量、上样量、逆转录效率等的试验误差干扰， 的基因的表达情况［１７－１８］。在荧光定量 ＰＣＲ实验 这就需要内参基因（Ｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｅ）作为参 中，前人在对杉木内参基因的选择上各不相同， 照物来校正样品间的试验误差［１－４］。内参基因的表 ＥＦ１、Ａｃｔｉｎ、２８ＳｒＲＮＡ等被选用，但是对杉木在不同 α 达量越稳定，越能更好地检测目的基因的特异性表 组织中内参基因的筛选和表达稳定性研究极 达水平［５－８］。针对不同的植物种类和组织部位，前