第六章水产动物病原的检测技术.docVIP

PAGE 2 第六章水产动物病原的检测技术 第一节 免疫学检测 第二节 PCR检测技术 第一节 免疫学检测 一、抗原抗体反应的一般规律和特点 1、高度特异性：抗体的可变区可与相应的抗原决定簇结合。（可有 交叉反应） 2、可逆性结合：非共价键结合。pH、电解质、温度可影响其结合。 3、抗原抗体结合的比例：适当的比例，才可出现肉眼可见的反应。 抗原与抗体结合价达饱和时，可出现肉眼可见的反 应，反之，无肉眼可见的反应。 4、可见反应的两个阶段（1）抗原与抗体快速结合阶段，几分钟； （2）出现肉眼可见的反应阶段，数分、数小时到数天，凝集、沉淀、细胞溶解。 二、抗原-抗体反应影响因素 1、电解质：可加速抗原抗体复合物的凝集与沉淀反应。 2、温度：水产动物最适反应温度为28-30oC 3、酸碱度：最适反应 pH 6-8，低于抗原的等电点，非特异凝集， 出现假阳性 三、免疫凝集试验 1、直接凝集试验（direct agglutinnation）颗粒性抗原+凝激素 2、间接凝集试验（indirect agglutinnation）可溶性抗原耦联致敏颗粒+抗体 3、间接血凝试验（indirect hemagglutinnation）可溶性抗原耦联血细胞+抗体 4、协同凝集试验（Co-agglutinnation）抗体Fc段耦联金黄葡萄球菌SPA+抗原 四、免疫沉淀试验 1、环状沉淀试验：抗血清+抗原界面处白色环状沉淀。（试管） 2、絮状沉淀试验：抗血清+可溶抗原混浊沉淀或絮状沉淀。（试管或凹玻片） 3、免疫浊度法：抗血清+可溶抗原浊度（比色） 4、免疫扩散抗体+抗原在凝胶上扩散相遇形成沉淀 五、与补体相关的试验 1、溶解试验 （1）溶血试验（ hemolysis test ）：红细胞+抗体+补体——红细胞溶解 （2）被动溶血试验（passive hemolysis test）：红细胞吸附抗原+抗体+补体——红细胞溶解 （3）溶菌试验（bacteriolysis test）：菌+抗体+补体——溶菌 2、补体结合试验(complement fixation teat,CFT) 第一系统：抗体+抗原+补体 第二系统：红细胞+溶血素（抗红细胞抗体） 六、酶联免疫试验（enzyme linked immunoasborbent assay,ELISA） 1、直接法：抗原+酶标抗体——酶底物发色 2、间接法：抗原+第一抗体+酶标第二抗体——酶底物发色 3、双抗夹心法：抗体+抗原+酶标抗体——酶底物发色 4、竞争法：抗体+待测抗原+酶标抗原——酶底物发色 5、常用酶及其底物 （1）辣根过氧化物酶（HRP） 3,3’-二氨基联苯胺(DAB) （2）碱性磷酸酶（AP）对硝基酚磷酸盐〔P-nitrophenyl phosphate;P-NPP〕 七、荧光免疫技术 原理：荧光物质为标记物+特定的激发光时，产生荧光通过荧光显微镜观察。用于细菌、病毒等检测 1、直接法：抗原+荧光抗体 2、间接法：抗原+第一抗体+荧光第二抗体 八、免疫电镜技术 1、铁蛋白抗体法： 2、酶标记抗体法： 3、重金属标记抗体法：胶体金法 第二节 PCR技术 一、PCR原理 多聚酶联式反应（plymerase chain reaction, PCR)：是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在条件下依赖于 DNA聚合酶的酶促反应。 PCR反应三部曲 （1）变性：解链（2）退火：引物结合（3）延伸： PCR产物 二、PCR条件的优化 1、 PCR反应缓冲液: 10-50mmol/L Tris-HCl 调pH值，适量Mg 2+ 2、底物浓度: 4种dNTPs系等量配比。 3、 PCR反应酶及其浓度: TaqDNA酶每100ul反应底物中其用量为0.5-5U。 4、引物: 浓度为0.1-0.5umol/L。 5、 PCR反应条件的选择: 94-95oC变性；40-60oC复性；延伸70-75oC。 三、PCR引物的选择及设计 1、引物长度：15-30bp 2、引物碱基尽可能随机分布：C+G含量应在45%-50% 3、引物内部不应形成二级结构 4、引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性 5、引物3末端碱基应与膜板DNA配对 6、引物5末端碱基没有严格的要求 四、PCR的实验步骤