第二章-细胞的分离与破碎.ppt

预处理--细胞的分离与破碎 2.1 细胞分离 重力沉降 离心沉降 过滤 重力沉降 重力沉降是化工过程中常用的气固、液固和液液分离手段，在生化分离过程中亦有一定程度的应用。 离心沉降 离心类别 离心沉降速度 离心分离法 离心分离设备 离心分离法 差速离心 区带离心 区带离心 区带离心(Zonal centrifugation)是生化研究中的重要分离手段，根据离心操作条件不同，分为 差速区带离心(Rate zonal density gradient sedimentation) 平衡区带离心(Isopycnic density gradient sedimentation) 密度梯度离心（density gradient） 密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的应用 过滤 过滤速度 过滤设备 细菌细胞外层结构 细胞破碎法 机械破碎 化学和生物化学渗透 物理渗透法 细胞破碎和产物释放原理 胞内产物释放速率模型 机械破碎 高压匀浆 珠磨 撞击破碎 超声波破碎 生产型高压均质细胞破碎机 ： 细胞破碎仪有一个数个往复运动的柱塞，物料在柱塞作用下进入可调节压力大小的阀组中，经过特定宽度的限流缝隙（工作区）后，瞬间失压的物料以极高的流速（1000-1500米/秒）喷出，碰撞在碰撞阀组件之一的冲击环上，产生三种效应：空穴效应、撞击效应、剪切效应。经过这三种效应处理过后，物料粒径可均匀细化到100nm以下，破碎率大于95%！ 化学和生物化学法 酸、碱处理 ；化学试剂处理；酶溶 物理渗透法 渗透压冲击法 冻结—融化法 包含体的分离和蛋白质复性 包含体的形成 包含体的分离和蛋白质的复性 思 考 题 渗透压冲击法 渗透压冲击(Osmotic shock)是在各种细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易于破碎的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌。将细胞置于高渗透压的介质(如较高浓度的甘油或蔗糖溶液)中，达到平衡后，将介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲溶液中。在渗透压的作用下，水渗透通过细胞壁和膜进入细胞，使细胞壁和膜膨胀破裂。 冻结-融化法 将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，此冻结—融化操作反复进行多次，使细胞受到破坏。冻结的作用是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性。另一方面，由于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂。冻结-融化法对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效。 2.1.2 细胞破碎原理 细胞破碎方法可分成两大类，一是机械法，二是非机械法，或是两者的结合。 机械法（主要有压缩力和剪切力）有珠磨法、高压均质法、超声破碎法、X-press法等；由于消耗的机械能转为热量会使温度上升，大多需冷却以防止生物品受热破坏。 非机械法有酶溶法、化学法、物理法等。 化学破碎利用化学或生化试剂(酶)改变细胞壁或细胞膜结构，增大胞内物质的溶解速率；或者完全溶解细胞壁后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。 由于细胞之间以及目标产物之间的性质差别很大，需通过实验确定适宜的破碎器和破碎操作条件，获得最佳的破碎效率。 提高破碎率意味着延长破碎操作时间或增加破碎操作次数，后者往往引起目标物的变性或失活。 过渡的破碎释放大量的胞内产物，给下游的分离纯化操作增加难度。因此，破碎应与整个下游加工过程相联系，在保证目标产物有较高收率的前提下，使下游加工过程的成本降低。 加压叶滤机 加压叶滤机占地面积小，单位容积过滤面积大。相对于板框过滤机，叶滤机在密封条件下过滤，适于无菌操作；但需要足够的空间来更换滤叶和清除滤饼，发酵工厂中常用于啤酒过滤，即垂直叶片硅藻土过滤机。 板框式过滤机：适用于要求滤饼较干的场合，不适用于含挥发性有毒物质或有生物危害的场合。 思考题 1、何谓沉降 2、沉降与离心的异同 3、离心设备可分为哪两大类 4、常用的离心沉降设备有哪些 5、常用的离心过滤设备有哪些 2.2 细胞破碎 生物产物可能存在于细胞壁、细胞膜、细胞质以及线粒体、核糖体、内质网和高尔基体等细胞器中。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，释放其中的目标产物。 胞外产物：微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢物、胞外酶、抗生素、多糖等，直接进行固液分离，即可进行滤清液的分离。 胞内产物： 某些目的产物不能分泌到细胞外，留在细胞内部，如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等。 随着重组DNA技术发展，许多有重要价值的生物产品应运而生，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等，基