限制性内切酶原理.PPTVIP

* II型限制酶 限制酶的定义 限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。限制酶在基因工程中广为使用。 限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶。细菌通过自身的限制酶，破坏入侵的外源DNA，从而保护自身。 30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。 EcoR I Escherichia 属名 Coli 种名 Ry13 株系 编号 切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率。可以估算该限制性核酸内切酶在某种DNA分子中的切点数。 前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、碱基排列在DNA分子上是随机分布的。这样每个位点上，每一种碱基出现的概率即为1/4 。 如果某限制性核酸内切酶的识别序列是6 bp，则其切割频率为(1/4)6 =1/4096，即每隔4.1kb就可能有一个切割点。当识别序列为n个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。 限制酶的种类 I型限制酶 通常其切割位点与识别位点相距千个碱基, 不能准确定位切割位点。例如：EcoB、EcoK。 II型限制酶 所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。 III型限制酶 切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。 什么是回文序列？ GAATTAAG C TTAATTC GAATATTC CTTATAAG ApaI ? ? 识别序列： 5GGGCC^C 3 BamHI 识别序列：?5 G^GATCC 3 BglII ? ? 识别序列： 5 A^GATCT 3 EcoRI? ? 识别序列： 5 G^AATTC 3 HindIII? 识别序列： 5 A^AGCTT 3 KpnI ? ? 识别序列： 5 GGTAC^C 3 NcoI?? 识别序列： 5 C^CATGG 3 NdeI?? ?识别序列： 5 CA^TATG 3 NheI?? ?识别序列： 5 G^CTAGC 3 NotI?? ? 识别序列： 5 GC^GGCCGC 3 SacI?? ? 识别序列： 5 GAGCT^C 3 SalI?? ? 识别序列： 5 G^TCGAC 3? SphI?? ? 识别序列： 5 GCATG^C 3 XbaI?? ? 识别序列： 5 T^CTAGA 3 XhoI ? 识别序列： 5 C^TCGAG 3? II型限制酶切割DNA后形成粘性末端或平末端分别由错位切和平切形成。能形成粘性末端的酶在基因工程中应用最多。 5’NNNGTT AACNNN3’ 3‘NNNCAA TTGNNN5’ ? 5’NNNGC GGCCGC NNN3‘ 3’NNNCGCCGG CGNNN5 ‘ ? HaeⅠ的识别序列 NotⅠ 的识别序列 ? 5’NNNGC-OH P-GGCCGC NNN3‘ 3’NNNCGCCGG-P HO-CGNNN5 ‘ ? 5’粘性末端 3’粘性末端 ? ? 5’NNGGTAC-OH P-CNN3‘ 3’NNC-P H