五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒....pdfVIP

五种致泻性大肠埃希氏菌多重PCR 检测试剂盒 研发背景 大部分的大肠杆菌是人或动物倡导的共生菌，但其中也有部分菌株可引起腹泻等疾病。 致泻大肠杆菌不但可引起传染性疾病而且可引起食源性疾病的暴发。根据发病机制、临床特 征、流行病学特征、O 抗原血清及细菌的毒力测定，可将致泻大肠杆菌分为5 类：致病性大 肠杆菌（EPEC）、产毒性大肠杆菌（ETEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、粘附性大肠杆菌（EAEC）、 出血性大肠杆菌（EHEC）。目前针对致泻大肠杆菌的常规实验室检测方法仍然较为薄弱，需 要研究快速、简便、准确的分子生物学方法。 【检验原理】 五种致泻性大肠杆菌（EPEC、EHEC、EAEC、EIEC、ETEC）共含有11 种毒力基因，针对 这11种毒力基因，天津生物芯片试剂盒使用11 对特异引物，与样本中基因组的相应靶位点 特异性结合，PCR 反应后，不同类型的样本产生不同的扩增片段，从而达到对五种致泻性大 肠杆菌快速分型检测的目的。 【使用方法】 1. 试剂配制（试剂准备区） 从试剂盒中取出PCR 反应液在室温融化，将PCR 反应液充分震荡混匀，所有试剂在使用 前2000rpm 离心10s。设所需要的管数n （n=样本数+1 管阴性对照品），每个测试反应体系 试剂配置如下表。计算所需要的n 管反应的各试剂的使用量，加入至适当体积的无菌离心管 中，充分混合均匀，分装至无菌PCR 反应管中，每管24μ l。 PCR 反应液 Taq 酶 每个反应体系试剂用量 23.5μ l 0.5μ l 2. PCR 扩增（扩增和产物分析区） 将样本、阴性对照品使用前恢复至室温，2000rpm 离心10s。向每个PCR 反应管中分别 加入样本、阴性对照品各1μ l，震荡混匀，于2000rpm 离心10s。将PCR 管放入PCR 仪中， 使用以下程序进行扩增反应，整个扩增反应约需2 小时： Step 1 94℃ 5min Step 2 94℃ 30s Step 3 63℃ 30s 30 个循环 Step 4 72℃ 90s Step 5 72℃ 5min 3. 结果判断（扩增和产物分析区） 从PCR 管中取出2μ l PCR 产物与9μ l 阳性对照品一起进行浓度为2%的琼脂糖凝胶电 泳检测，在紫外灯下阳性对照品从上至下应有 11 条带，分别为 1487bp、1111bp、910bp、 766bp、655bp、544bp、400bp、324bp、244bp、171bp 和102bp。 样品观察到 1487bp、910bp、544bp 条带即为毒力基因uidA、bfpB 和escV 阳性，即为 典型EPEC 菌株。 观察到1487bp、544bp、324bp、244bp 条带即为毒力基因uidA、escV、stx2A 和stx1A 阳性，即为典型的EHEC 菌株。 观察到1487bp、655bp 和171bp 条带即为毒力基因uidA、elt 和estlb 阳性，即为典型 的ETEC 菌株。 观察到1487bp 和766bp 条带即为毒力基因uidA 和invE 阳性，即为典型的EIEC 菌株。 观察到 1487bp、1111bp、400bp 和 102bp 条带即为毒力基因uidA、pic、aggR 和astA 阳性，即为典型的EAEC 菌株。 阴性对照品结果应为阴性。 产品特点  高效鉴定：通过同步扩增致泻性大肠埃希氏菌典型毒力基因和种属鉴定基因，快速实现 对EPEC/ EHEC/ ETEC/ EIEC/ EAEC 等五种致泻性大肠埃希氏菌的型别划分和鉴定。  精确提示毒力基因信息：试剂盒覆盖五种致泻性大肠杆菌全部 11 种毒力因子，通过对 条带大小或荧光信号的判读即可轻松获得待检样品所携带的毒力基因信息。  配备设备要求低：该产品对仪器要求不高，普通分子生物学实验室