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一个遗传性血管性血友病家系的实验室诊断和分子发病机制研究 中文摘要 中文摘要 Willebrand 血管性血友病(yon Willebrand fcator,VWF)缺乏或功能异常所致的出血性疾病。根据发病原因分为遗 传性和获得性两大类。遗传性血管性血友病主要为常染色体显性遗传，少数为隐 性遗传。遗传性vWD的不同分类及亚型分型具有不同的分子发病机制。研究该病 的分子发病机制，有助于了解VwF蛋白的结构与功能的关系，对于临床诊断、治 疗和预后都有重要的意义。 目的：采用一系列vwD诊断实验、分型实验，对一个出血性疾病患者及其家 系明确诊断，并对先证者及家系受累成员的血管性血友病因子(VWF)基因进行 分析，探讨其发病机制。 方法： LinkedImmunosorbent 一)应用酶联免疫吸附法(Enzyme InducedPlatelet 斯托霉素诱导的血小板聚集实验(Ristocetin 及VWF多聚体电泳等方法分析vWD患者家系三代6位成员临床表型。 --)PCR扩增先证者及家系成员的V岍基因的52个外显子及其侧翼序列并 测序，通过Chromas软件将测序结果与NM000552．3序列进行比对。根据检测到 胞裂解液。转染后的上清以40倍的比例浓缩。ELISA法检测细胞上清及细胞裂解 液中VWF抗原含量，并采用多聚体电泳法对细胞上清进行VWF多聚体分析。 结果： V岍多聚体分析显示大分子量多聚体缺乏，而血小板VWF多聚体分析无异常。 中文摘要 一个遗传性血管性血友病家系的实验室诊断和分子发病机制研究 同时先证者VWF：Ag／VWF：CB2，这与以往报道相一致。 RIPA、VWF：CB均明显低于正常范围，同时血浆VWF多聚体分析显示大分子量 多聚体缺乏，血小板VWF多聚体分析无异常。 3、先证者的VWF基因52个外显子及其侧翼序列扩增测序，发现第28号外 A2区的氨基酸D1529．V1530 显子存在杂合的6个碱基GATGTG的缺失，导致VWF 缺失，其四位受累家系成员测序结果也有相同的基因的改变。为确定所发现的VWF 基因缺失这一改变属基因突变还是基因多态性，我们共检测了68位正常人的VWF 基因的第28号外显子基因，未见该基因改变。 4、野生型及突变型VWF表达载体转染HEK293细胞后，检测细胞裂解液中 VWF抗原含量，突变型与野生型无明显差异；而细胞培养上清中，单转突变体的 细胞上清VWF含量显著降低，约为野生型的26．894-4．64％，共转突变型和野生型 的细胞上清中VWF含量也显著降低，为野生型的37．834-5．29％，VM多聚体分 析突变型浓缩上清中V岍大分子量多聚体缺如。 ． 结论： 1、根据先证者及受累家系成员临床症状、体征以及VwF相关实验室检查， 可明确诊断为2A型vWD。 2、基因分析发现先证者及其他4位家系成员的V岍A2结构域内一杂合的6 报道，为新发现的基因突变。 3、体外细胞水平研究提示，VWFD1529．V1530缺失影响VWF的多聚化及 分泌，从而影响Ⅶ『F的功能，为该家系的分子发病机制。 关键词：血管性血友病因子；血管性血友病；基因突变 作 者：董静 指导老师：董宁征 II 一个遗传性血管性血友病家系的实验室诊断和分子发病机制研究 英文摘要 T _ · -● ‘ ● - I ■ ● 』● LaDoratoryandmolecular