高效液相色谱培训(HPLC使用与维护).PPT

2. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱 对溶剂的要求 水： 去离子水 自动纯水仪 　　　纯净水　　 商品瓶装水 溶剂: 色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）　 试剂: 分析纯 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要求越高放置时间越短。 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 过滤与脱气 流动相的保存 有机溶剂流动相： 室温下密封，避光保存 缓冲盐流动相： 当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长 有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相： 低温密封保存 防止有机相的挥发 选用适宜的容器 1．梯度洗脱的特点 （1）改善分离, 加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕量组分的检测； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段平衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有差异, 可能会引起基线漂移 2．梯度洗脱的主要条件 ① A 流动相/弱溶剂组成； ② B 流动相/强溶剂组成； ③ 梯度时间； ④ 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。 强溶剂 A% time 1 2 5 梯度洗脱 1 2 3 梯度：低压混合 低压梯度 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积 如设计不当，梯度的准确性受影响 滞后体积（系统体积）设计合理 梯度滞后：系统体积的影响 死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时) 滞后(系统)体积 滞后(系统)体积 溶剂输送系统(泵) 检测器 进样器 色谱柱 梯度混合器 溶剂输送系统(泵) 高压梯度 注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路 比例阀 检测器 进样器 A B C D 色谱柱 溶剂输送系统(泵) 低压梯度 阻尼器 混合器 梯度滞后大小的影响 滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好 普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml 滞后体积变化的影响 设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果： 梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性 梯度百分比 保留时间 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 保留时间 梯度百分比 不好的梯度 滞后曲线 固定滞后体积，改善了梯度性能 普通的低压梯度系统 液相色谱的色谱柱 色谱柱的连接 Stop_depth长度不合适造成柱前死体积 锥箍锥度不合适造成渗漏 色谱柱的连接 除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的固定相。 色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适的溶剂进行洗净。 采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再生。 可能提高柱效的方法 HPLC检测器应提供的功能 对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系 理想的HPLC检测器 高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应 对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性 灵敏度：信噪比 灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N） 检测限（LOD）：S/N = 2~4 定量限（LOQ）：S/N = 8~10 好的信噪比有利于： 更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性 6:1 N S 吸光度（Absorban