原核表达及蛋白质的纯化.docVIP

原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定 之一原核表达 实验材料 1.大肠杆菌BL21.DH5a 2.高盐LB：蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NacL10g（低盐LB为5g），溶于双蒸水，然后定容至1000ml中，121.6℃高压灭菌25min-30min 3.LB固体培养基：按上述方法配制的液体培养基，每100ml加1.5g琼脂粉，高压灭菌25min-30min，待培养基温度降至常温左右时（一般为不烫手即可），在无菌状态加入抗生素（3g/200ml）并铺平板，冷却凝固后放入4℃ 4.IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃，这时配好的IPTG浓度为0.8m/mL 5.氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）： 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml 6.卡那霉素（carbenicillin）（50mg/ml）： 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml 7.考马斯亮兰染色液：称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中 ，量取250mL的异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解。加入100mL的冰乙醋酸，均匀搅拌。加入650mL的去离子水，均匀搅拌。用滤纸出去颗粒物质后，室温保存。 8.考马斯亮兰脱色液：量取下列溶液，醋酸（冰乙酸）45mL；甲醇?50mL；dH2O 10mL,充分混合后使用。 9.10%过滤酸铵 ：把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4 ℃ 10. 5×Tris-GlycineBuffer?（SDS电泳缓冲液）配制方法 ：称取下列试剂，置于1L烧杯中。 Tris? 15.1g；Glycine?94g ；SDS 5.0g；加入约800mL的去离子水，搅拌溶解。加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。 实验原理 大肠杆菌是重要的原核表达体系,在重组基因转化入大肠杆菌菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS以检测表达蛋白质。实验室常采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达，不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。 操作程序及结果判定 （一）构建重组表达载体 1、载体酶切：将原核表达载体（例如：pET-28a）用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收所需要的载体大片段。2、PCR产物双酶切后经DNA纯化与回收试剂盒（或者切胶回收）回收后，同样在用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒回收所需要的片段 注：一般需要先连T载体克隆增值，然后再连原核表达载体。 （二）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或kan）作筛选，挑取单斑，用小提试剂盒抽提质粒，双酶切初步鉴定。2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架（有无因为碱基的缺失所造成的移码），如果均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞（如BL21）。 （三）诱导表达 1、挑取含重组质粒的菌体单斑至5ml低盐LB液体培养基中含Amp或kan中37℃过夜培养。 注：A.同时做空载体（如pET28a）的诱导作为对照;本实验室常用的Amp或Kan，若为A100（100mg/ml）的话5mL LB加5微升，若为K50（50mg/ml）的话5mL LB也加入5微升。 B.接种表达和接种做感受态都类似，一定要用挑单克隆、加足量抗生素、过夜培养的新鲜菌液转种最好，在筛选压力下生长旺盛的种子液远比经过4℃保存的菌液要好得多，也许是因为保存时间长会导致抗生素失效部分细菌丢失质粒或者其他变化。2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100ml高盐LB液体培养基的250ml培养瓶中（最好是500ml，以免转速太高碰到瓶口造成污染），37℃震荡培养至OD600 ≌0.4-1.0（最好0.6，一般大约需2-3h，不同菌体时间不同 3、取1ml液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.8mM（IPTG:液体培养基=1：1000，即100ml培养基加入100微升）作为实验组，两组继续在37℃中震荡培养3h.4h.5h.6h。4、分别取菌体1ml，离心12000rpm×1min或8000rpm×6min收获沉淀（即菌体），用40微升灭菌水重悬沉淀