纤维素酶液体发酵最佳培养基的确定.doc

纤维素酶液体发酵最佳培养基的确定 第35卷第3期 2005年9月 工业微生物 IndustrialMicrobiology VoI_35No.3 Sept.2005 纤维素酶液体发酵最佳培养基的确定 余晓斌,郝学财 (江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,无锡214036) 摘要用响应面法对里氏木霉WX—ll2液体发酵产纤维素酶的培养基进行了优化.首先用快 速登高路径逼近最大产酶区域,然后根据快速登高法的实验结果进行响应面实验.运用逐步回归 分析法,获得滤纸酶活与豆饼粉,麸皮,KH2P04,微晶纤维素粉(Avice1)的最优回归方程,且分析 了各因子间的交互效应.最后,通过岭脊分析确定了滤纸酶活达最大值10.53Iu/mL时的最佳组 合条件:豆饼粉3.18%,麸皮2.95%,KP040.25%,Avicel3.79%. 关键词:纤维素酶;里氏木霉;滤纸酶活;响应面方法;岭脊分析 纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的 总称.它可以将纤维素转化为糖类,同时通过对细 胞壁降解,使细胞内溶物释放出来1J,因而在纺织工 业,食品加工,中草药中有效成分的提取,家畜饲养 及植物遗传工程中都得到广泛应用.随着人们对纤 维素酶作用机制,纤维素的超分子结构认识的深入, 纤维素酶的应用也将日趋广泛. 培养条件的优化是提高纤维素酶酶活,降低生 产成本的重要途径之一_2],由于纤维素酶是诱导酶, 其生物合成的调控受诱导剂的约束,因此培养基的 组成对产酶有着非常重要的影响.优化发酵培养基 通常用单次单因子法和正交试验设计法,但它们都 无法找到整个区域上各个因素的最佳组合和响应值 的最优值3].而响应面分析方法试验次数少,周期 短,求得的回归方程精度高,又能研究几种因素间交 互作用.本实验首先用快速登高路径逼近最大产酶 区域,然后进行响应面实验,最后通过岭脊分析确定 了滤纸酶活达最大值时的最佳组合条件.实验结果 为里氏木霉液体发酵生产纤维素酶的进一步扩大试 验奠定了一定的基础. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1试验菌株 实验用菌株为里氏木霉高产变异株WX一112, 由本实验室选育并保存. 1.1.2培养基 起始摇瓶培养基(%):豆饼2,麸皮2.5, KI-I2PO40.3,Avicel3,蛋白胨0.4,及无机盐,pH值 自然. 优化摇瓶培养基(%):豆饼粉3.18,麸皮2.95, KH2PO,0.25,Avicel3.79,蛋白胨0.4,及无机盐, pH值自然. 1.1.3主要仪器 721型分光光度计;电热恒温水浴锅;TGI一 16C台式离心机;HYG—A全温摇瓶柜. 1.2分析测定方法 1.2.1还原糖测定 采用DNS法HJ 1.2.2滤纸酶活(FPA)测定及酶活单位定义 取适当稀释酶液0.5mL加入1mLpH4.8的 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液,再加入新华1号滤纸 条(0.5cm×5cm)一片,在50℃酶解30min,然后进 行还原糖测定,最后再扣除发酵液中的还原糖含量. 50℃下,每分钟水解底物生成1/,mol葡萄糖所 对应酶活定义为1个滤纸酶活单位(IU). 1.3试验设计 1.3.1快速登高法实验 快速登高法实验以实验值变化的梯度方向为登 高方向,根据各因素效应值的大小确定变化步长,能 作者简介:余晓斌(1965--),男,博士,副教授. 电话:0510—5876272,E—mail:xbyu@sytu.edu.cn 一 1一 第3期工业微生物第35卷 快速,经济地逼近最佳值区域].根据实验设计要 求,以豆饼粉(z.),麸皮(Z2),KH2PO4(Z3),Avicel (Z4)的百分含量为自变量,滤纸酶活(Y)为目标函 数,对试验因子的设计水平进行线性编码代换(表 1),以编码值拟定试验设计方案(见表2,3),做三次 重复试验.具体的编码公式如下: fZoj=(zlj+Z2j)/2 △j=(Z2j—Z.,)/2 【)(i=(zj—Zoj)/△ 其中,Z2j,zIj,Zoj,△j和Xj分别表示第j个自然 因素zj的上水平,下水平,零水平,变化区间和编码 因素. 1.3.2响应面实验 逼近最大产酶区域后,进行响应面实验.采用 响应面实验结果来建立多项式回归模型,多项式回 归模型表达式为: 444 Y=b0+∑+∑bxj+∑bsj 其中,b0常数项;bj一次项回归系数;b互作 回归系数;6,二次项回归系数. 2结果与分析 2.1快速登高法试验 根据本实验室以前的研究],在里氏木霉产 纤维素酶的液体发酵培养基中,豆饼粉(z.),麸皮 (Z2),KH2PO4(Z3),Avicel(Z4)这4种成分的含量是 影响产酶的主要因素.对每一个因素选择适当的零 水平和相对狭窄的变化区间,具体设计见表1. 表1试验因素水平表 根据表1因素水平用一次