羟胺法测定SOD活性.doc

羟胺法测定SOD活性 ????(一) 原理????·O2氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐, 后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色, 在波长530nm处有最大吸收峰, 可用分光光度法进行测定, 当SOD消除·O2后形成的亚硝酸盐减少。????????(二) 仪器与试剂????1. 仪器????721分光光度计；离心机；恒温水浴；匀浆器。????2. 试剂????(1) 1/15mol/L磷酸盐缓冲液pH7.8；????(2) 10mmol/L盐酸羟胺: 盐酸羟胺6.95mg, 加水至10ml；????(3) 7.5mmol黄嘌呤: 黄嘌呤11.41mg, 加水至10ml；????(4) 0.023U/ml黄嘌呤氧化酶: 25U/0.9ml黄嘌呤氧化酶8.4μl加pH7.8磷酸盐缓冲液至10ml；????(5) 10g/L甲萘胺；3.3g/L对按基苯磺酸；3g/L磺基水杨酸；SOD标准品；????(6) 三氯甲烷；95%乙醇(V/V)。????(三) 实验步骤????1. 红细胞抽提液制备 50μl全血冲入0.5ml生理盐水, 2000r/min离心3min,弃上清, 加冰冷的双蒸水0.2ml混匀, 加入95%乙醇0.1ml, 振荡30s, 加入三氯甲烷0.1ml, 置快速混合器抽提1min。 4000r/min离心3min, 分层, 上层为SOD抽提液,中层为血红蛋白沉淀物, 下层为三氯甲烷, 记录上清液体积待测。????2. 组织匀浆的制备 剪取一定量的所需脏器, 生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎, 至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min匀浆10s, 间歇30s, 反复进行三次, 制成10%组织匀浆, (最好用超声波发生器处理30s), 使线粒体振破, 以中性红─詹钠氏绿B染色证明线粒体已振碎, 以4000r/min离心5min, 取上清液20μl待测。????3. 样品测定????????4. SOD标准抑制曲线 将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/ml的溶液, 再稀释到50倍, 即SOD量为15U/ml(1.5μg/ml), 用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率, 以百分抑制率为纵坐标, 以SOD活力单位U/min为横坐标绘制标准曲线。????????式中: A──对照管OD????B──测定管OD????(四) 结果计算????每ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个单位。????????式中: A──对照管OD????B──测定管OD????V──反应液总量(ml)????N──样品稀释倍????W──取液量????也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SOD U/ml, 乘以稀释倍数(1ml/取样量)。????若样品为组织匀浆液, 根据匀浆浓度或组织蛋白质含量, 将单位换算为U/g组织或U/mg蛋白。