重楼的组织培养.docVIP

重楼的组织培养 1.外植体的选择与消毒 1.1外植体的选择 据李群等对重楼组织培养外植体有4个取材时期，即萌芽期、展叶期、花冠露白期和倒苗期，子房取自花冠露白期，叶片取自萌芽和展叶期，幼芽取自萌芽期、展叶期、倒苗期，试验结果表明，其中以展叶期旺盛生长的根茎作外植体，其愈伤组织的诱导频率最高，达16.6%，萌芽期取材次之，在花冠露白期和倒苗期，根茎则很难诱导产生愈伤组织。 根和叶片既不能诱导出愈伤，也不能诱导出小球茎，接种后很少启动，污染也较少，大约2个月后干枯死亡。而根茎、子房、幼芽都能不同程度地诱导出愈伤组织，特别是幼芽，不但诱导出的愈伤组织块数最多，诱导频率最高，达68. 25%，且还能诱导出小球茎。可见，不同的外植体的诱导频率差异很大。 在四川峨眉山海拔2000 m左右的环境下，重楼属植物的生长期一般为4月至5月中下旬，大约二个月左右的时间。因此，取材时间应在4月至5月上旬这段时间。但在这段时间取材培养，会发现外植体极易污染。必须采取一些措施减轻或控制外植体的污染。. 1.2外植体的消毒 接种前置于18 e 弱光下保存，一般滞留2-4d即接种培养。 取重楼的芽，自来水冲洗2-3h，去除表层的芽鞘，再用自来水冲洗干净后，蒸馏水冲洗3遍。在无菌条件下，用75％酒精消毒30S，无菌水冲洗3-5次，0.1％升汞灭菌15min，无菌水冲洗5-8次。将芽外部的芽鞘按层剥下，切成长宽分别为1cm 左右的小块，芽内部不能分层的部分按切外层芽鞘的大小切成小块，接种到愈伤组织诱导培养基上，一般幼嫩的芽和叶片灭菌3-4min；根茎灭菌10min，子房和根灭菌6-8min。灭菌以后的材料用无菌水清洗3-5次，最后接种于培养基（1）上，置于（20±2 )℃培养温度，光照时间8h/d的 培养基：（1）MS+BA 1.0 +IAA 2.0 和 MS+BA 2.0 +IAA 1.0 培养基上，不但能诱导愈伤组织，还能诱导出小球茎。 2.愈伤组织的形成 在上述培养基中，形成的愈伤组织增殖较慢，但愈伤组织的质地较坚硬，呈淡黄色，有较好的保持潜力，从外植体来看，幼芽基部形成的愈伤组织增殖较快，愈伤组织呈颗粒状，较易分散，根茎形成的愈伤组织质地较疏松，时间长了以后，愈伤组织易纤维化，失去增殖能力，子房形成的愈伤组织也较疏松，且易褐变。 芽组织切块接种到愈伤组织。 25d后，接种切块开始膨大；再过15d左右，接种块切口处逐步形成淡黄色表面粗糙突起质地较坚硬的愈伤组织。 3.愈伤组织的增值与分化 增值与分化培养基：（2）MS+6-BA2 +NAA0.5 +KT0.5 把诱导出愈伤组织的切块转接到培养基（2）上，愈伤组织开始缓慢增殖：90d后再转接到新的培养基（2）上；经过约180d，增殖到直径约0.5cm的愈伤组织块由淡黄色逐步变为白色，表面由粗糙突起逐步变为平滑：再过30d后，逐步分化形成一个芽。分化出的芽如果不进行生根诱导，在培养基（2） 4.诱导生根 生根培养基：（3）1/2MS+NAA0.5 +IAA0.5 将分化出的芽切下，接种于培养基（3）上进行根的诱导。在培养过程中芽的基部逐步褐化伸长成根茎状，培养60d左右，在褐化伸长前端芽的基部可长出2-3条根，生根率为76.3％。 5.结论 5.1据报道（李群、张丽琼），利用组织培养来繁殖重楼的难度很大，只有芽段可成功诱导出植株，而茎尖的诱导虽然启动，但效率较低，尤其是不含皂甙成分，根茎、子房虽可诱导愈伤组织，但愈伤组织的增殖受到极大限制，而重楼其他外植体(如：根、叶片等)的组培技术到目前为止还没有成功的报道。利用幼芽诱导的愈伤组织生长缓慢，并有的不含原植物中的甾体。 5.2重楼愈伤组织的诱导周期太长，采用芽诱导是可以诱导出小块茎，但这方面的未见报道。我们可以从这个方面着手，即外植体幼芽→小块茎→芽→小苗。 5.3据报道，重楼愈伤组织有的不含甾体，是指某一阶段不含，还是从愈伤组织到芽都不含，这目前还未见相关报道，但，我们在实验过程中可以分阶段来测定其含量。 5.4在重楼我们可以通过细胞悬浮培养等方法是否会提高其含量。 5.4.1重楼愈伤组织悬浮培养体系的建立 将得到的愈伤组织称取2g接种于含100ml的培养液中的250ml的三角瓶中，旋转震荡培养，转速110r/min，温度25℃ 5.4.2重楼小球茎悬浮体系的建立 将组培中得到的小球茎称取3g接种于1/2MS+0.6 mg/LABA中，的250ml的三角瓶中，旋转震荡培养，转速110r/min，温度25℃ 但重楼的细胞悬浮培养未见相关报道，在这里我们参照半夏的细胞悬浮培养来进行实验，看是否可以成功。 5.5重楼组织培养困难关键在于如何加快愈伤组织的诱导率、正确引导愈伤组织快速增值、 目前重楼愈伤组织比较成功的是云南农业科学院高山植物经济植物研究所