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观察DNA和RNA在细胞中的分布——Brachet反应 ?光镜下常用的核酸染色方法 ?Brachet反应的染色原理 ?甲基绿（Methyl green)和 吡罗红(Pyronin, 又译派若宁、派洛宁，又称焦宁） ?染色液（Unna试剂）的配制 ?方法步骤及结果的比较 ?可参考书目 光镜下常用的核酸显色方法 染色原理 将甲基绿和派若宁配成混合染液（Unna试剂）时，甲基绿多和DNA选择性结合显示蓝绿色，派洛宁多和RNA选择性结合显示红色。其原因可能是当配成混合染液时，两种染料同时存在而出现竞争作用：甲基绿与DNA亲和力大,易和聚合程度高的DNA结合，而派洛宁与聚合程度较低的RNA结合。但空间构型不完整的DNA也能与派洛宁结合显示红色。 故用该法所得的红色反应来显示RNA的存在并不具有专一性。需做对照试验：利用专一性的RNA酶使嗜派洛宁染色性消减，这种反应具专一性，借助该反应才能说明被染上红色的确是RNA，故做对照实验是必要的。 DNA 染料 甲基绿 甲基绿生产厂家不同，甚至批号不同染色效果会有较大差别。商品甲基绿常混有甲基紫，会影响染色效果。 甲基绿溶于水，不溶于氯仿（三氯甲烷）；甲基紫溶于氯仿。利用该特性可用氯仿洗脱甲基紫：将甲基绿水溶液放入分液漏斗，加入氯仿，用力振摇，然后静置，待溶液分层后弃氯仿。如此反复数次，直到氯仿不呈紫色为止。 派若宁 有Pyronin Y、B等，Y是四甲基化合物，B是四乙基化合物。 有学者认为Y适用于该反应，B会使胞浆产生非特异性染色。 染色液（Unna试剂）的配制 甲液：5%Pyronin水溶液 （可加热助溶） 6ml 2%甲基绿水溶液 6ml 蒸馏水 16ml 乙液：1M醋酸盐缓冲液（pH=4.8） 16ml （配方：A液：冰醋酸6ml加蒸馏水至100ml B液：醋酸钠13.6克加蒸馏水至100ml 取A液40ml＋B液60ml混匀即为pH=4.8的缓冲液 一周内有效，用前现配） 甲乙两液分别置4℃冰箱备用，用时混匀。 （上述配法参考汪德耀主编《细胞生物学实验指导》 1981 高教版 其它配法可参考芮菊生等编著《组织切片技术》 1980 高教版） 配制注意事项：①吡罗红（Pyronin）可加热助溶。②甲基绿(Methyl green)批号不同，染色效果差别很大。商品甲基绿常混有甲基紫，影响染色效果，应先把药品放在分液漏斗中，加入足量的氯仿，用力振荡，然后静置，直到洗脱甲基紫为止，最后干燥备用。 方法步骤及结果的比较 一.核心步骤： Unna试剂染色5～30′染色前不做盐酸处理也可观察到正确的染色结果. 二.辅助性步骤: (一).盐酸处理 此步骤需处理得当才有高中教材中所述作用效果。若浓度过高、处理温度过高、时间过长，结果核不是呈蓝绿色，而是与细胞质一样呈红色。 关于盐酸浓度：质量分数8%盐酸处理所得结果 体积分数8%盐酸处理所得结果 (二)有些资料介绍染色后用丙酮短时间(多为30〞）处理有分色的效果 方法与步骤实例 (洋葱鳞茎内表皮) 方法与步骤实例 (人口腔上皮细胞) 可参考书目 汪德耀主编《细胞生物学实验指导》 1981 高等教育出版社 芮菊生等编著《组织切片技术》 1980高等教育出版社 徐根兴著《定量细胞学和细胞化学技术》1993 吉林科学技术出版社 赵刚、刘建中主编《医学细胞生物学实验与习题》1999 科学出版社 王金发、何炎明主编《 细胞生物学实验教程》2004 科学出版社 * * 必修一实验三 ? 显示DNA——多用Feulgen反应:1N盐酸 60℃水解 8～10分钟(使DNA分子暴露出醛基)，水 洗去盐酸后,用Schiff 试剂染色 该反应优点：1。专一性强 2。可用于定性和定量分析 ?显示RNA——多用Brachet反应 该反应优点：可同时显示DNA和RNA 缺点：专一性不强（1。甲基绿、派若