斑点印迹杂交.ppt

斑点印迹杂交; 掌握斑点印迹杂交的原理及方法 ;杂交：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。 斑点杂交：是指将待测的DNA变形后点加在硝酸纤维素膜（或尼龙膜）上，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未结合的探针），放射自显影，判断是否有杂交或其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。根据点样磨具不同，点样形状呈圆形称为斑点杂交，呈狭缝形则称为狭缝杂交。; 斑点印迹杂交不需要电泳和转移，杂交过程包括点样，变性，中和，干燥固定，预杂交，杂交，封闭，检测杂交结果等步骤，相对southern印迹杂交和Northern印记杂交来说快，适合于同时分析多个样品。 ;实验步骤： 变性：按8:1将80ul ddH2O加入至10ul待测DNA样品中，稀??样品。100℃加热10min后，立即置于冰中5min（使DNA变性），加入90ul 20×SSC混匀。 点样：将上述变性后的样品180ul点在尼龙膜的毛面上，真空抽滤，室温下风干后，于烤箱中120℃烘烤15min。使变性的DNA与膜结合牢固 预杂交：将膜封入15ml离心管中，做好剪角标记。加入预杂交液3ml。置42℃恒温摇床上，轻轻振摇30min。封闭杂交膜上多余的非特异性DNA结合位点 杂交：加入探针3ml（生物素-DNA），置42 ℃恒温床上，轻轻振荡1-2h。变性DNA与探针结合;5 洗膜：倒掉杂交液，洗液1(每次5ml）洗膜三次（洗液1预热到42℃），每次5min；再将洗液2 (每次5ml）洗膜两次（预热到42℃），每次15min。洗去未结合的探针，否则本底会太高 6 封闭：倒掉洗液2，加入5ml封闭液，37℃作用15min。封闭杂交膜上非特异性的蛋白结合位点 7 酶联抗体结合：倒掉封闭液，加入3ml亲和素-辣根过氧化物酶（HRP），于37℃轻轻振摇30min。酶联抗体与生物素结合 8 洗膜：倒掉第七步骤中液体，加入5ml洗液3，洗膜三次，每次2-3min。洗去未结合的酶联抗体 9 显色：洗膜后，加3ml的显色液避光显色1-2min，斑点出来后就可倒掉显色液，用ddH20冲洗几次，终止显色。 ;斑点杂交预期结果图; 制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪或直接点样）