白念珠菌菌落PCR方法的建立和应用.docVIP

PAGE PAGE 1 白念珠菌菌落PCR方法的建立和应用 　　摘要：白念珠菌（Candidaalbicans）是临床上引起系统真菌感染的主要病原真菌，在白念珠菌临床鉴定和基因组功能研究中，通常要提取其基因组DNA以进行PCR。以白念珠菌菌落为材料，通过蜗牛酶处理后直接进行PCR，从而建立一种简捷快速的PCR模板获取方法。结果表明，该方法避免了提取转化子基因组DNA的过程，可以大大提高工作效率。 　　关键词：白念珠菌；菌落PCR；基因敲除；基因型验证 　　中图分类号：R379.4文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.07.003 　　EstablishmentandApplicationofColonyPCRMethodinCandidaalbicans 　　LIXi-chuan 　　（BasicMedicalResearchCenter，TianjinMedicalUniversity，Tianjin300070，China） 　　Abstract：Candidaalbicanswasthemostclinicallyimportanthumanfungalpathogenandcausessystemfungalinfections.ThepreparationofCandidaalbicansgenomicDNAwasnecessaryintheclinicalidentificationandgenomefunctionalresearch.Here，arapidcolonyPCRmethodbyusingthesnailasetreatmentofCandidaalbicanscolonywasdescribed.TheresultsshowedthatthismethodcouldlargelyincreaseworkingefficiencybyavoidingthepreparationofgenomicDNA. 　　Keywords：Candidaalbicans；colonyPCR；genedisruption；genotypeconfirmation 　　白念珠菌（Candidaalbicans）是临床上最常见的机会型致病真菌，人体系统真菌感染主要是由白念珠菌引起的[1-2]。然而，目前用于临床治疗系统真菌感染的药物数量有限，而且菌株耐药性现象日趋加重。因此，对白念珠菌基因功能的研究近年来得到人们的普遍重视，这将为抗真菌药物新靶点的发现提供重要线索。人们对白念珠菌基因功能的了解通常通过传统的遗传学方法来实现，即敲除目的基因然后观察基因缺失株的表型以发现该基因的功能。白念珠菌是双倍体，通常需要分两步敲除两个等位基因（alleles）才能最终获得一个目的基因的纯合缺失突变体（homozygousmutant）。常用的敲除基因的方法有两种，一是1993年由Fonzi创立的“URA-BLASTER”法，目前仍被广泛使用[3-4]，二是直接PCR扩增含有标记基因的DNA片断，引入细胞内进行同源重组[5-7]。在使用这两种方法敲除基因的过程中，需要先后两次PCR检测敲除转化子的基因型，从而筛选到目标基因的杂合缺失突变体（heterozygousmutant）和纯合缺失突变体。由于白念珠菌转化效率的局限性，经常需要通过PCR检测几十个甚至于上百个转化子的基因型才能得到一个正确的目标基因缺失突变体。因此，在转化子基因型验证试验中，按照传统的PCR方法，需要使用玻璃珠加酚/氯仿抽提法提取大量转化子的基因组DNA做模板。这种方法工作量大，用时长，操作繁琐，严重限制了基因敲除效率的提高。此外，酚和氯仿对人体有毒害作用，试验后留下的残留物处理不当会污染环境。 　　在真核模式生物酿酒酵母菌（Saccharomyceasecerevisiae）的基因敲除工作中，人们已经建立了简捷、高效的菌落PCR方法用于菌株的基因型验证[8-10]。该方法从平板上挑取单菌落，通过简单处理后直接用于PCR，避免了提取基因组DNA的过程。但是，到目前为止在白念珠菌基因敲除过程中尚无采用菌落PCR方法检测基因型的报道。本研究在参考酿酒酵母菌的菌落PCR方法的基础上，首次建立了白念珠菌的菌落PCR方法。该方法具有操作简捷、成本低廉且无环境污染的优点。 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　1.1.1菌株与引物白念珠菌野生型菌株SC5314，RM1000和CaTCO89基因的纯合缺失株（tco89Δ/tco89Δ）分别来自以前研究[4，11]，rck2Δ/rck2Δ和ipf7530.2Δ/ipf7530.2Δ缺失株由本实验室构建。本试验中用到的所有引物由北京奥科生物技术公司合成。扩增IPF7530.2基