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三代测序之PacBio SMRT技术全解析 2017-05-11 11:29 来源: 基因谷 技术 气温回升，天气渐暖， 花儿开了一簇又一簇~ 在这美好的季节里， 我们准备聊点新话题。 今天小编要来和你分享： PacBio SMRT测序那些事儿~ 测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。与前两代相比，第三代测序有什么不同呢？今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT测序平台。 PacBio SMRT测序原理 Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理如下： 聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部 4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部 荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光 荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基 统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列 酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落 聚合反应持续进行，测序同时持续进行 PacBio SMRT测序原理 PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的？我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。 SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅地降低了背景荧光干扰。 SMRT Cell和ZMWs 将荧光染料标记在核苷酸的磷酸链而不是碱基上，当核苷酸掺入到新生的链中，标记基团就会自动脱落，减少了DNA合成的空间位阻，维持DNA链连续合成，延长了测序读长。SMRT测序最大限度地保持了聚合酶的活性，是最接近天然状态的聚合酶反应体系。 荧光标记在焦磷酸链上的核苷酸 PacBio SMRT测序送样要求 PacBio SMRT测序建库流程 DNA打断之后，经过末端修复、接头连接、片段筛选、杂交测序引物和聚合酶绑定，即可出库准备上机测序，建库过程无PCR反应。 PacBio SMRT建库流程 PacBio SMRT技术特点 PacBio SMRT技术有两种测序平台，RSⅡ和Sequel，应该如何选择？小编已将二者的对比表准备好啦~ 表3 RSⅡ和Sequel测序平台比较 Sequel平台与RSII平台相比具有很大的优势，Sequel平台测序通量高、单Gb数据成本低、周期短。 第三代基因测序技术又被为Single Molecule Real Time (SMRT?) DNA Sequencing（单分子实时DNA测序技术），该方法基于纳米孔的单分子读取技术，不需要扩增即可快速读取序列。目前，Pacific Biosciences公司已经成功推出了商业化的第三代测序仪PacBio RS平台，使得第三代测序正式走入人们的视角。 PacBio RS II是Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time, SMRT），其专利的SMRT Cell含有15,000个纳米级的零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs），每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。 2 ?技术特点 ü??利用测序过程聚合酶反应的动力学变化，首次实现对碱基修饰进行直接测序。 ü??超长的读长：平均测序读长能达到7,000-8,000bp，最长读长能达到3,0000bp； ü??准确率高：对基因组组装和基因组变异检测，可以最多达到99.999%的准确率； ü??敏感性强：可以检测频率在0.1%的minor variants； ü??无PCR扩增偏好性：样本不需要进行PCR扩增，避免了覆盖度不均一和PCR artifacts； ü??最小的GC偏好性（GC bias）：在极端高GC和极端低GC区域，可以轻松测定，从而保证序列的均匀覆盖度。 3 数据产出 试剂盒 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??平均读长 ? ??数据量/SMRT Cell P4-C2 Chemistry ??5.5