SDS-PAGE电泳操作规范.docVIP

聚丙烯酰氨凝胶电泳 一 简介 作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native）及 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据 蛋白质的 分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的 电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和 丙烯酰胺凝胶中加入离子 去污剂和强 还原剂（SDS即 十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的 电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。 二 作用 SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强 还原剂如 巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的 二硫键断裂。在 样品和凝胶中加入 还原剂和SDS后，分子被 解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的 电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的 分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低 电导区，而 电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 三 电泳过程 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使 电荷因素消除，那 电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和 巯基乙醇，可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A(1A=10的负十次方米），这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于 分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。因而SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈 线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条 标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的 电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。 四 操作步骤 所需试剂及仪器： 试剂：丙烯酰胺，双丙烯酰胺，Tris-base，TEMED，SDS，过硫酸铵，甘油，溴酚兰，甘氨酸，DTT，考马斯亮蓝R-250，甲醇，冰醋酸，蛋白Marker5只（50ul装），小牛血清白蛋白10mg。 仪器设备：电泳仪、槽、板5套；10ml小烧杯10只，微量移液器5把，普通移液器5套，足量滤纸，0.45μm滤器。 母液：