CAT的活性测定-紫外吸收法.docVIP

过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法 一、仪器与用具 紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴； 二、试剂 0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液 0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。 [0.1mol/L H2O2：市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定； 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定； 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。] 三、步骤 1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.2g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.8磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10ml离心管中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液。置5℃冰箱中静置10min，在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。 2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。 表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表 管 号 S0 S1 S2 粗酶液(ml) 0.0 0.2 0.2 pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5 蒸馏水(ml) 1.2 1.0 1.0 25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。 四、结果计算： 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= 式中 A240 = AS0－ AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2—样品管吸光值； Vt—粗酶提取液总体积（ml）； V1—测定用粗酶液体积（ml）； FW—样品鲜重（g）； 0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。