动物细胞培养的基本方法.ppt

第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式 动物细胞大规模培养： 在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，贴壁依赖)等。 已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 依细胞种类：原代培养、传代培养 依培养基：液体培养、固体培养 依培养器和方式: 静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养。 生产实际来看：悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。 一、动物细胞大规模培养的方法 1、悬浮培养（suspension culture） 让细胞自由的悬浮于培养基内进行生长繁殖。 适用细胞类型：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤 设备：通气搅拌式生物反应器、气升式生物反应器。 生产药物：单克隆抗体；干扰素。 缺点：细胞体积小，且处于悬浮状态，难采用灌流培养，细胞密度低。 2、贴壁培养 必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。 适用细胞类型：贴壁依赖型细胞，兼性贴壁细胞。 基质要求：具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具有一定电荷密度。 缺点： a操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积。 b培养条件不易均一，传质和传氧效果差。 c不能有效地监控细胞的生长。 贴壁培养系统：中空纤维；玻璃珠；微载体培养。 贴壁培养和悬浮培养的不同之处是在传代或扩大培养时，常常需要用酶将其从基质上消化下来。 3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养 将悬浮培养和贴壁培养相结合的方法。 ①微载体培养：细胞贴附在载体表面。创造大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖；载体体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一切优点。 载体：葡聚糖、聚苯乙烯、胶原等。 理想的微载体应具备： 生物相容性；无毒性；表面惰性；比重适当（1.030-1.045g/ml）；粒径均一，在60-250?m之间（溶胀后）；光学透明；柔软；耐高压灭菌温度；反复多次使用；制备简单、原料充分。 80年代以后发展的多孔微载体或多孔微球，增大了供细胞贴附的比表面积。 应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原 ②包埋或微囊培养： 将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。 可用于包埋细胞的载体材料为：人工合成的高分子聚合物；糖类如纤维素等；蛋白质如胶原、纤维蛋白等。 包埋法： 将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法。 优点：步骤简单，条件温和，负荷量大，细胞泄露少，抗机械剪切。 包埋法 缺点：扩散限制，并非所有的细胞处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。 一般适用于非贴壁依赖性细胞的固定。 常用的载体：琼脂糖；海藻酸钙凝胶 微囊法： 用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊内，细胞不能溢出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜。 囊内是微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。 ③结团培养： 利用细胞本身形成结团的特点，相互结团后再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了用于微载体的成本。 二、动物细胞培养的操作方式 1、分批式操作 将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将条件培养基，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。 另一种是先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反应物取出。 2、半连续式操作 当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。 该操作方式在动物细胞培养和药品生产中被广泛采用，它的优点是操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。 3、灌流式操作 当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。 细胞被固定，在取出部分条件培养基和补充新鲜培养基时，细胞基本上都被保留在反应器内。 第六节 动