血红蛋白的提取和分离教案.docVIP

血红蛋白的提取和分离 一?蛋白质分离的依据 蛋白质各种特性的并异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质 和对其他分子的亲和力等,可以用來提取和分离不同种类的蛋白质。 二、凝胶色谱法 1 ?概念:也称做分配色谱法;是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的冇效方法。 凝胶色谱法原理 ⑴由多糖类化合物构成的凝胶,内部有许多贯穿的通道。 ⑵当相对分子质量不同的蛋门质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内 部的通道，路程较长,移动速度较慢，而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通 道,只能在凝胶外部移动，路程较短,移动速度较快，从而使相对分子质量不同的蛋白质分了 得以分离。 （1）识图析图 图a,相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留;相对分子质量 较大的蛋口质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。 图b,①优白质混合物上柱；②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内; 相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒Z外；③相对分子质量较小的蛋白质被滞阳， 相对分子质量较大的蛋白质向卜?移动；④相对分子质量不同的分子完全分开；⑤相对分 了质量较人的蛋白质行程较短，已从层析柱屮洗脱出来,相对分了质量较小的蛋白质还在行 进中。相对分子质量不同的蛋口质分子因此得以分离。 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 三、缓冲溶液 作用：在一左范围内，缓冲溶液能抵制外界的酸卷碱对溶液pH的影响，维持dH基本不变。 配制：山1?2利缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到在不 同pH范围内使用的缓冲液。 注意：在血红蛋门整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液,冃的是利用缓冲液模拟细胞内 的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能,便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）。 四、电泳 概念:指带电粒子在电场的作川卜-发牛?迁移的过程。 原理:在一定的pHT,多肽、核酸等生物大分了的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分了会向着与其所带电荷担反的电极移动。 作用：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、形状的不同, 使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品■ 11各种分子的分离。 方法:常用的电泳力法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定蛋1‘1质和对分子质 量时通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。 相关知识：测定蛋白质相对分了质量通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋口质分子的基本单位是氨基酸，氨基酸的些基团在一定的pH下会发主水解或电离 从而带有电荷。但总的來说蛋白质分子一般带有负电。在电场的作用带电的黃白质分子 会向着电泳槽中的正极方向移动。由于样品中各种蛋白质分子净电荷的量的差异以及蛋白 质分子本身的大小等因素,使蛋白质分子产生不同的迁移速率，从而将样品中各种蛋白质 分了分离开。 由于蛋口质分子带电电荷比较复杂，净电荷总量与蛋口质分子的质量不成正比，而不同 蛋口质分子的质量乂是衡定的，电泳时在带电量和分子质量两种因索的作川下会产生迁移速 率的复杂化，不能正确地将分了质量不同的蛋白质分了分离开. 因此，实际操作中，一般会将蛋白质分子与SDS （十二烷基硫酸钠）发生反应形成蛋白 质一SDS复合物，由于SDS所带负电荷的量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因此掩盖了 不同种蛋白质间的电荷差异，使蛋白质的迁移率完全取决于蛋白质分子质量的大小。在电 场条件下，分子量大的蛋白质迁移率慢， 场条件下，分子量大的蛋白质迁移率慢，i 前沿较远，而分子量小的蛋白质迁移快，离前 沿较近。 这样，不同分子最人小的蛋白质得到了分离。如果蛋白质的纯度高，迁移率一致，就会形成 前沿整齐、清晰的条带。 五、实验操作过程 （一）一般步骤：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 样品处理： （1）红细胞的洗涤： 反复加生理盐水并低速短时离心，去除上清液，直到上清液不呈现黄 色为止。 ①洗涤目的：去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。 洗涤操作: 低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果） 用胶头滴管吸取血浆，上层透明的黄色血浆 用胶头滴管吸取血浆，上层透明的黄色血浆 下层暗红色的红细胞用盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9%的氯化钠溶液洗涤 重复三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净 （2）血红蛋白的释放: El的：在蒸馅水和甲苯作用下,使红细胞破裂释放血红蛋白。（蒸锚水是为了使红细胞吸 水胀破;甲苯是为了溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放与分离。） 过程: 40%体积的甲苯 磁力搅拌器上充分搅拌1O分钟 ill L红蛋白释放 （3）分离血红蛋白溶液： 过程：将搅拌好混合液转移