基因工程2-分子克隆工具酶.pptVIP

大肠杆菌 DNA 聚合酶I 单链多肽，相对分子量：109kDa 5’-3’DNA聚合酶活性 底物：模板（ssDNA）及引物（带3’-OH） 或5’突出dsDNA 5’-3’外切核酸酶活性 底物：dsDNA或DNA:RNA杂交体 活性：从5’端降解dsDNA， 也降解RNA:DNA中的RNA（RNase H活性） 3’-5’外切酶活性 底物：3’-OH dsDNA或ssDNA 活性：从3’-OH端降解DNA，可被5’-3’ 聚合活性封闭 用途: 切口平移法标记DNA（只有该DNA聚合酶有此活性） 用于cDNA克隆中第二链的合成（由于其5’-3’外切酶活性而不再使用） 末端标记（交换或置换反应） T4噬菌体DNA聚合酶 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌,114kDa 活性: 与Klenow酶相似（没有5’-3’外切酶活性，其它同大肠杆菌DNA聚合酶I），但3’-5’外切活性强200倍； 不从ssDNA模板上替换引物，在诱变反应中更有用. 用途： 补平或标记3’凹端（必须有高浓度dNTP） 置换反应（必须有一种高浓度dNTP） 标记DNA片段（即利用外切活性产生了3’凹端再用标记的dNTP补平） 将dsDNA变成平端，需高浓度dNTP 定点诱变（在ssDNA-dsDNA过程中，由于T4不置换引物，效率提高1倍） 反转录酶 (Reverse transcriptase) 依赖于RNA的DNA聚合酶,有5’-3’合成DNA活性,无3’-5’外切核酸酶活性. 来自AMV(禽成髓细胞瘤病毒)或M-MuLV(鼠白血病病毒) 反 转 录 过 程 示 意 图 第四节 其它分子克隆工具酶 RNA聚合酶 连接酶 T4多核苷酸激酶碱性磷酸酶 核酸酶 RNA聚合酶 (RNA polymerase) 识别DNA中启动子特异序列,合成RNA,无需引物 SP6噬菌体RNA聚合酶 来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株 T4或T7噬菌体RNA聚合酶 来源于感染的大肠杆菌 用途 体外合成RNA分子 用于表达外源基因 连接酶(ligase) T4 DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶 T4多核苷酸激酶 碱性磷酸酶 T4多核苷酸激酶可将ATP的γ-磷酸基团转移至DNA或RNA的5’末端。主要用于对缺乏5’磷酸DNA或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。 碱性磷酸酶主要来源于牛小肠碱性磷酸酶（CIP或CIAP）能催化除去DNA或RNA5’磷酸的反应，可防止DNA片段自连。 核酸酶 BAL31核酸酶 活性:对dsDNA主要为3’外切核酸酶活性,对ssDNA表现为内切酶活性.反应时依赖Ca2+ ,EDTA可抑制其活性. 用途:（i）诱发DNA发生缺失突变；（ii）定位测定DNA片段中限制位点的分布；（iii）研究超螺旋DNA分子的二级结构， S1核酸酶 活性:一种单链核酸酶,可降解ssDNA或ssRNA,对dsDNA、dsRNA或DNA:RNA杂交体不敏感.酶过量时可消化双链. 用途: 分析DNA:RNA杂交体的结构,给RNA分子定位 . 脱氧核糖核酸酶I（DNase I） 活性:为内切核酸酶，优先从T或C处水解ds或ssDNA。Mg2+存在时，随机切割DNA；Mn2+存在时，在同一位置切割dsDNA，产生平末端或1-2nt突出的DNA。 用途: （i）切口平移标记，在dsDNA上随机产生切口；（ii）在闭环DNA上引入单切口以使分子截短；（iii）建立随机克隆，以便安插在M13噬菌体上测序；（ⅳ）分析蛋白：DNA复合物（DNA酶足迹法）；（ⅴ）除去RNA样品中DNA。 核糖核酸酶H（RNase H） 外切核酸酶Ⅲ（exonulease Ⅲ ） 底物：线状dsDNA和带切口或缺口的环状DNA 活性：从dsDNA3’羟基端逐一去除单核苷酸，在dsDNA上产生长长的单链区。 用途：（i）制备部分截短的DNA，用作探针；（ii）在dsDNA上产生末端序列嵌套缺失的成套缺失体；（iii）定点诱变。 活性：内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，不降解单链核酸、dsDNA或dsRNA。 用途：cDNA克隆合成第二链之前去除RNA；在脱氧核苷酸指导下特异性切割RNA；分析体外polyA反应的产物。 特性：去除线性单链、双链 DNA 和切刻质粒 DNA，但对超螺旋质粒 DNA 不起作用。 应用于 Gibson 组装方法：T5 核酸外切酶沿 5′ →3′ 方向降解 DNA。它既能从 5′ 末端起始消化，也能从线性或环状双链 DNA 的切刻或缺口处起始消化。但不能降解超螺旋双链 DNA，T5 核酸外切酶还具有单链 DNA 核酸内切酶活性。 T5