白芨组织培养实施方案.docxVIP

白及组织培养实施方案 一、白及简介 白及为兰科白及属多年生草本植物，又名甘根、连及草、地螺丝、羊角七、皲口药、利知子、刀口药、鱼眼兰等。分布在中国、日本以及缅甸北部，主产于 贵州、四川、湖南、湖北、安徽、河南、浙江、陕西等地。其味苦、甘、涩 , 性 , 归肺、胃、肝经。以块茎供药用，能收敛止血，消肿生肌；治肺结核咳血，支气管扩张咯血、胃溃疡吐血、尿血、便血等症。外用治外伤出血、烧烫伤、手足皲裂等症。块茎含黏液质和淀粉等，可作糊料，在生物医药、保健食品、纺织印染、特种涂料和日用化工等方面有巨大的商业利用价值。 又因白及为地生兰的一种，花开艳丽，被作为庭院、居室及园林景观绿化苗木大量应用。 白及一般生于海拔 110—— 3200m的山野、山谷较潮湿处或林下半遮阴地带，喜温暖、稍阴湿的环境，耐阴性强，忌强光直射，需排水良好、富含腐殖质的砂 质土壤，稍耐寒，冬季可在地下越冬。白及能产生大量的种子( 每个蒴果 10～30 万粒 ) ，但这些种子没有胚乳，自然萌发率极低，繁殖困难，但白及胚的薄壁细 胞贮存大量的蛋白质、 油脂和碳水化合物， 可作为种子萌发的营养成分， 因此白及种子在保湿的情况下可以萌发， 是兰科植物中种子易萌发的类型。 传统的白及繁殖方法大多以分株为主， 即将块茎分成小块种植， 但繁殖系数低， 大面积发展对种源消耗大，不宜推广且难以满足市场需求。 采用白及组织培养可在短时间内大量获取种苗， 且成本相对较低， 是提高白及产量的强有力措施。 目前，国内研究资料报道的白及组织培养方法各异， 所采用的外植体各不相同， 且培养基及其中所加的植物生长调节剂种类和规格也千差万别。 二、白及组织培养技术路线 参照植物组织组织培养获得再生植株的方式， 可通过 4 种途径获得白及再生 植株：一是由愈伤组织形成不定芽再生植株； 二是愈伤组织产生胚状体而再生植 株；三是由侧芽或顶芽再生植株；四是由茎尖产生原球茎而再生植株。 4 种方式 各有利弊，传统认为采用侧芽或顶芽发育途径获得的后代性状较稳定， 但因为白 及原球茎带有大量共生菌，组培过程中容易出现污染。 结合卢氏当地实际， 探索采用白及无菌播种的技术路线， 通过不同浓度和培方的培养基实现白及组织培养的最佳技术路线， 建立白及快繁体系。 白及组织培养完整的技术路线如下： 经过试验优化后的技术路线为： 白及→种子（采集优质种源蒴果） →表面消毒→无菌播种（ MS培养基等）→原球茎（分化诱导）→白及小苗（分株、扩繁）→壮苗生根（炼苗）→完整小植株→炼苗 20-25 天→移栽→白及 三、实验准备： 种子： 白及的蒴果中有大量的种子，并且蒴果的消毒较方便，污染率低。 另一方面用种子作为外植体操作较容易， 并且组培过程中萌发率高， 培养的幼苗 生长较为迅速， 因此，种子作为外植体应用比较广泛， 大部分的组培研究都选用 种子。本实验选取卢氏本地优质白及（ Bletilla striata (Thunb．)Reichb． f．）蒴果，采收时间为 8 月下旬至 9 月中旬，此时间段胚龄大约为第 8 周至第 22 周。 器材：高压灭菌锅、超净工作台、电子分析天平（精度为千分之一）、电磁 炉、接种消毒器、高效能培养架、医用小推车、日光灯、加湿器、紫外灯、晾瓶 架、酸度计（或 PH试纸）、试管、容量瓶、胶头滴管、试剂瓶、烧杯、试管架、 量筒、玻璃漏斗、移液管、三角瓶、广口培养瓶、称量纸、毛刷、洗耳球、塑料 筐、无菌脱脂棉、无菌滤纸、酒精灯、喷壶、橡胶手套、医用白大褂、紫外灯、 镊子、接种针、剪刀、解剖刀、器械架、接种托盘等。 （1）通用器械 ①烧杯：用来盛放、溶解化学药剂等。常用的规格有 50 mL、100mL、250mL、 500mL、1000mL。 ②烘箱：用来烘干器械。 ③恒温水浴：用来溶解琼脂等物质。 ④玻璃搅拌棒：用来配制培养基。 ⑤洗耳球：用来辅助吸取、转移少量液体。 ⑥冰箱：用来贮存化学药剂、植物材料等。 ⑦牛角勺：用来转移化学药剂。 ⑧玻璃漏斗：用来过滤溶液。 ⑨剪刀：用来修剪外植体或剪切嫩茎。 ⑩器械架：在无菌操作期间用来放置灭菌的器械。 （2）各种盛具 ①搪瓷浅盘：用来承载各种器械容器。 ②塑料盆：用于清洗培养容器。 ③铁丝筐：用来盛放灭菌容器等物品。 ④纯水水桶：用来存放去离子水或蒸馏水。常用的规格有 10L、20L。⑤塑料桶：用来存放洗涤溶液、废弃溶液。⑥各种规格的磨砂玻璃瓶：用来盛放培养母液，以及各种植物生长物质。（3）计量器械 ①量筒：用来量取一定体积的液体。 常用的规格有 25mL、50mL、100mL、500mL、1000mL。 ②容量瓶：用来配制标准溶液。 常用的规格有 50mL、100mL、500mL、1000mL。 ③大肚移液管：用来吸取定量溶液。常用的规格有 1mL、5m