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目视LAMP技术对人乳头瘤病毒18亚型检测应用价值探究 ［摘要］目的探讨环介导等温扩增技术用于检测 临床标本乳头瘤病毒HPV18亚型的应用价值。方法 设计针 对HPV18-L1基因序列中6个区段的4条特异引物，在等温 条件下(65* )进行核酸扩增反应lh,在扩增前加入钙黄绿 素作为反应指示剂；利用建立的环介导等温扩增方法进行敏 感型检测以及检测正常体检妇女和患者子宫颈分泌物的 HPV18亚型。结果LAMP检测HPV18L1基因的敏感度为1000 拷贝每微升；阴道炎患者HPV18阳性检出率为5. 26%(1/19)； 慢性子宫颈炎组HPV18亚型检出率为10% (2/20)；宫颈上皮 内瘤变(CIN I?II级)阳性检出率33.3% (3/9)；子宫颈 癌I级阳性检出率为64% (16/25)。结论基于目视的环介 导等温扩增方法是一种具有经济、快速筛查临床标本中 HPV18亚型的诊断工具，可具有在基层医院推广应用的潜能。 ［关键词］人乳头瘤病毒；核酸；环介导等温扩增试验 ［中图分类号］R737. 33 ［文献标识码］A ［文章编号］ 2095-0616 (2013) 18-09-03 在妇科恶性肿瘤中，子宫颈癌是仅次于乳腺癌的威胁妇 女健康的第二杀手。全球每年大约有47万妇女罹患宫颈癌 ［llo HPV病毒几乎在所有子宫颈癌病例中都存在，是引发子 宫颈癌的元凶［2］。临床上用于检测HPV的方法包括免疫组 化、原位杂交、斑点杂交、核酸印迹和PCR等，PCR检测以 基因扩增为基础，灵敏度高，是目前进行HPV基因检测及分 型的最好方法［3］,但该技术对实验条件和操作技术要求较 高，需要专门的PCR仪器和实验场地，因此不利于在基层医 院推广。环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是由 Notomi 等于 2000 年研发的一 种新颖的恒温核酸扩增方法［4］。这种方法应用针对6?8个 靶序列的4?6条特异性引物，利用一种具有链置换活性的 DNA 聚合酶(Bst)在等温条件下(60?65°C左右)保温1? 2h,即可实现核酸的大量扩增，从而保证LAMP技术的特异 性，通过肉眼观察扩增产物颜色的变化即可判断样本中是否 存在特异性DNA扩增片段。因其敏感、快速、不需特殊仪器 设备的优点，LAMP方法已经广泛用于病原体的核酸检测 ［5-7］。据报道HPV18相关宫颈癌早期诊断率低，感染HPV18 相关的宫颈癌癌前病变进程更快，HPV18也是宫颈癌再发的 独立危险因素［8］。HPV16或HPV18的女性，其病程发展至宫 颈癌前病变的风险远高于未感染者［9］, HPV晚期基因L1编 码的病毒主要衣壳蛋白L1是病毒的重要抗原，故本研究拟 以HPV18的L1基因为靶基因，建立环介导等温扩增方法， 旨在探素可在基层医院操作的核酸筛查方法，从而可以帮助 基层医院临床医师更好地找到HPV感染者，判断她们患癌的 近期和远期风险，及时发现早期病变，尽早治疗，预防宫颈 癌的发生。 1资料与方法 1. 1 一般资料 将2008年5月?2013年5月我院就诊及手术的患者， 标本为专用宫颈刷收集的宫颈分泌物，所有病例均经病理证 实。实验观察组73例，其中阴道炎患者组19例，慢性宫颈 炎组20例，子宫颈上皮内瘤样病变(cIN) I?II级9例， 子宫颈癌I期25例，患者年龄28?72岁，平均47.8岁。 对照组60例，年龄25?70岁，平均41. 5岁。 1.2 HPV18检测方法 1.2. 1环介导等温扩增实验取待检妇女的子宫颈涂 片，一部分用作经典HPV细菌学检查，另一部分采用QIAamp DNAKit提取刮片组织DNA,进行核酸扩增实验。分别将HPV 病毒DNA、待测样本DNA、去离子水加入到0?加L无菌微量 离心管，按照设计分别依次加入既定浓度的BstDNA聚合酶 (8U)、 DNTPS (1.4mmol/L)、 Betaine (1.0mol/L)、 MgS04 (6. Ommol/L).引物对(FIP 和 BIP 各 1.6umol/L, F3 和 B3各0.2umol/L)以及钙黄绿素显色剂(1 uL),混匀反应 体系后将反应管置于65*水浴孵育60min,肉眼观察各反应 管颜色变化，显色后管内溶液颜色变为绿色为阳性，棕色为 阴性。 1.2. 2 HPV18 -L1基因的LAMP扩增引物F3 : CCTAAGAAACGTAAACGTGTT； B3: CAGGAACCCTAAAATATGGATT； FIP： AGGAGGTGGAAGATATACGGTATTCCCTATTTTTTTGCAGATGGC； BIP : GGCAAGAGTTGTAAATACCGATGACCAACAGTTAATAA