植物根系活力的测定（α萘胺法）及过氧化物酶活性的测定（比色法）.docVIP

植物根系活力的测定（α─萘胺法）及过氧化物酶活性的测定（比色法） 2005理科强化班 薛宣扬陈鸿【实验目的】 1.掌握α─萘胺氧化法测定根系活力方法 2.比色法测定过氧化物酶活性的原理和步骤。 【实验原理】 植物的根系能氧化吸附在根表面的α─萘胺，生成红色的α—羟基—1—萘胺，沉淀于有氧化力的根表面，使这部分根染成红色，其反应如下： 根对α—萘胺的氧化能力与其呼吸强度有密切关系。日本人相见、松中等认为α—萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的催化作用，该酶的活力愈强，对α—萘胺的氧化力也愈强，染色也愈深。所以，可根据染色深浅定性地判断根的活力；也可测定溶液中未被氧化的α—萘胺量，以确定根系活力的大小。α—萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮染料，在中性环境下于540nm处有最大吸收峰，可供比色测定α—萘胺含量。 另一方面，过氧化物酶活性反映某一时间植物体内代谢的变化。在过氧化氢的存在下，过氧化物酶氧化愈创木酚，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm处吸光度变化来测定过氧化物酶活性。 【实验过程】 1材料、仪器设备及试剂 1.1 材料：菹草。取生长季节的新鲜菹草，洗净，用滤纸吸干表面水分，待用。 水培水稻等植物根系 1.2 仪器设备：分光光度计；电子分析天平；振荡器；刻度试管（或普通试管）；试管架；移液管（10ml、2ml、1ml）；移液管架；吸水纸；洗耳球；黑纸；100ml三角瓶；100ml量筒。 1.3试剂及配制： 50μg/ml α－萘胺母液的配制：精确称取0.1000g分析纯α－萘胺溶于约50ml蒸馏水中（微微加热），冷却后定容至100ml，即为1000μg/mlα－萘胺溶液，保存于棕色瓶中，置低温黑暗处保存。使用前吸取1000μg/ml α－萘胺溶液50ml加蒸馏水稀释至1000ml即为50μg/mlα－萘胺母液。 1％对氨基苯磺酸溶液配制：称取1g对氨基苯磺酸溶于100ml 30％乙酸中。 100μg/ml亚硝酸钠溶液配制：称取0.1g亚硝酸钠溶于1000ml蒸馏水中。 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0） 2.2处理方法 2.2.1α—萘胺氧化法 2.2.1.1定量测定 取50μg/ml的α—萘胺溶液和0.1mol/l pH7.0的磷酸缓冲液各25ml，置于三角瓶混匀。称取1-2g根系浸入三角瓶；同样，不放根系做一对照瓶。5min后分别从两瓶中各取2ml溶液，加入10ml蒸馏水，再在其中加入1%对氨基苯磺酸溶液1ml和亚硝酸钠溶液1ml，在室温中放置5分钟，待混合液变成红色，再用蒸馏水定容到25ml。在25min后选用波长510nm，读取吸光度。 将两瓶于25 2.2.1.2绘制α—萘胺标准曲线 取浓度为50μg/ml的α—萘胺溶液，配制成浓度为40、30、20、10、5、0μg/ml的系列溶液，各取2ml放入试管中，按上述步骤测吸光度。然后以A510为纵坐标，α—萘胺浓度为横坐标，绘制标准曲线。 根据第一次和第二次样液所测得的吸光度值，从标准曲线查出α－萘胺含量，按下公式计算α－萘胺氧化值。 2.2.1.3计算： 取1 g鲜根，振荡1小时，以第一次取样时的α-萘胺浓度为A（是根上吸附的氧化铁氧化α-萘胺后剩余的α-萘胺浓度，亦即酶促反应前α-萘胺的起始浓度），第二次取样时的α-萘胺浓度为B（即根在酶促反应3小时后剩余的α-萘胺浓度）。所以A-B为根的α-萘胺氧化量，C为空白试验时α-萘胺减少的浓度（即α-萘胺在振荡1小时的自身氧化量）。由于所用溶液是等体积的50μg/mlα-萘胺溶液和磷酸缓冲溶液，共50 mL，所以每mLα-萘胺含量为25 μg，X为稀释液体积（mL），由于取样为2 mL，酶促反应是在48 mL的α-萘胺溶液中进行的，其计算公式如下： 其中：Y代表α-萘胺氧化量（μg/ gFW·h） 2.2.2 以菹草材料提取酶液，以50ml pH6.0磷酸缓冲液+28μl愈创木酚+19μl 30%过氧化氢配取反映混合液。以3ml反应液+0.2ml磷酸缓冲液将分光光度计调零，再以3ml反应液+0.2ml酶液加入比色杯，立即计时，每隔10s读取数据，直至OD470≥1.000。 过氧化物酶活性(U/gFW·min)=⊿A470×/W××0.01×t 2.3数据资料的统计分析 2.3.1α— C 0 5 10 20 30 40 OD 0.000 0.094 0.213 0.431 0.595 0.825 1.3.2α—萘胺含量定量测定 OD值 0 10 20 实验组 0.520 0.