生物分子的分离纯化完整课件.ppt

Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质，蛋白质的分离纯化往往要采取多种方法联合使用，并通过预实验进行条件优化，逐步地制备高纯度或高比活的靶蛋白，实现蛋白质分离纯化的目标 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质样品的纯度鉴定 蛋白质的纯度（purity）一般指是否含有其它杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内，一定条件下的相对均一性。目前常用的鉴定纯度的方法有：有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS、毛细管电泳（CE）、等电聚焦电泳（IFE）及高效液相色谱（HPLC）。此外，还有超速离心法、蛋白质的化学组成和结构分析法。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质的定量和分子量测定 蛋白质的定量，通常是指测定溶液中的蛋白质浓度。测定蛋白质总量的方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，此法虽有普遍性，但操作繁琐，目前极少使用。 应用较为广泛的方法是双缩脲法、福林-酚法和紫外吸收法。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 测定蛋白质混合物中某一特定靶蛋白的含量通常要用具有高度特异性的生物学方法。活性的测定和总蛋白量的测定配合起来可以用来表示分离纯化过程中某一特定靶蛋白的纯化程度。纯化程度常用这一特定成分的含量（一般用活力单位）与总蛋白量（质量单位）之比来表示。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 确定了蛋白质的均一性后，蛋白质的定性以及一级结构的研究，都需要测定蛋白质的分子质量以及亚基和寡聚体的分子质量。测定蛋白质分子质量的方法很多，这些方法都是根据蛋白质的理化性质来测定分子量的，由此测得的分子量称为物理分子质量。与物理分子量相对应的是化学分子量，化学分子量是从化学分析所得的结果，计算而得到的最小分子质量。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 四、生物小分子的提取纯化 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 1、溶剂提取法 2、水蒸气蒸馏法 3、升华法 4、超临界流体萃取法 5、超声提取法 6、固相萃取法 常用提取方法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 分离精制的原理主要是根据： 1）物质溶解度差别； 2）物质在两相溶剂中的分配比不同； 3) 物质的吸附性差别； 4）物质分子大小差异等进行分离 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 常用纯化方法 1、逆流分配法（CCD） 2、液滴逆流色谱法（DCCC） 3、高速逆流色谱法（HSCCC） 4、气液分配色谱（GC或GLC） 5、液-液分配色谱 6、凝胶过滤法 7、超滤法 8、硅胶吸附色谱 9、氧化铝吸附色谱 10、大孔吸附树脂吸附色谱 等 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 回收率 为提高DNA片段的回收率，可通过提高DNA样品的上样量和选择适宜的方法与材料而实现。 2. 纯度 常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法（column chromatography）。 柱层析法采用的是阴离子交换层析的原理 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的方法主要有 二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）-纤维素（cellulose）膜插片电泳法 电泳洗脱法（透析袋及非透析袋电泳洗脱法） 冷冻挤压法 低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。它是将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。 该方法能很好地回收小于1 kb的ss或ds-DNA，依分子量不同，其回收率从小于30%至大于90%不等。回收的DNA纯度极高，无酶抑制剂，也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法