微生物技术应用课件-4分离纯化.ppt

按层析过程的机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同而分离。 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同，使不同组分分开。 （二）层析法的分类 按操作形式不同分类： 柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。 （二）层析法的分类 （三）吸附层析技术 1基本原理 吸附层析法（液-固色谱法，LSC） 原理：利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。 特点：适合分离不同种类的化合物(醇类和芳香烃）。 2 吸附剂 吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，与待分离物质的极性官能团作用。 常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等。 羟基羟基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2]，可用于分离蛋白质与核酸。其表面有Ca2+和PO43-两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与Ca2+结合；碱性蛋白质可与PO43-结合。HA柱层析最重要的用途之一是分离单链DNA和双链DNA，因为它对双链DNA的亲和力大于单链DNA。 （四）分配层析技术 分配层析法（液-液层析法，LLC） 原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。 分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数。 K=c1/c2 分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。 特点：液-液层析法适合于分离同系物或同分异构体 A B C D E 32 16 16 8 16 8 4 4 12 12 2 2 8 12 8 层析柱分离物质的示意图： 固定相为固体颗粒，装在层析柱内，高5cm，固定相周围充满液体流动相，每厘米柱中液相体积为1cm3。若在柱顶加入1cm3溶剂,其中含32mg样品，同时应有相同体积的溶剂从柱底流出，此时样品处于柱中A位置。若样品的分配系数是1，则它在固相与液相间等量分配。若再有1cm3的溶剂加到柱上，A部分中的溶剂带着16mg的物质向下移动到B，A和B中的物质都将发生再分配 不同组分的含量 不同组分在柱中的位置 上部 中部 下部 不同物质分配系数不同时： （五）凝胶过滤层析技术 1基本原理 概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。 凝胶层析分离原理 2 凝胶的种类和性质 （1）交联葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex) 1) Sephadex G G 反应凝胶的交联程度，G值越大，孔穴越大；G后的数字为凝胶吸水值的10倍，G-25表示1g干胶可吸水2.5g。 2） SephadeX LH—20，是Sephadex G—25的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质。 2 凝胶的种类和性质 （2）琼脂糖凝胶 Pharmacia公司产品称 Sepharose ; Blo-Rad公司的叫 Bio-Gel A 琼脂糖凝胶机械强度高，可分离物质的分子量范围较宽，最大可以达到108。 （3）聚丙烯酰胺： 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品名为生物胶—P（Bio-Gel P). （4）聚丙乙烯凝胶（Styrogel)：大网孔结构 3 凝胶过滤在实验室中的应用 1）生物大分子物质的分离纯化 2）分子量的测定 3）分级分离 4）溶液浓缩 5）细胞及颗粒的分离 LogM A B C LogM测 V测 LogM=k1-k2Ve 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关： （Ve为洗脱体积） 先测得几种标准蛋白质的 Ve，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出 待测样品的Ve，查标准曲 线即可确定分子量。 1原理：根据离子交换树脂对需要分