第十三章 高效液相色谱法.pptVIP

第十三章高效液相色谱法 一、概述 generalization of HPLC 二、高效液相色谱仪 Instrument of HPLC 三、影响分离的因素 factors influenced separation 四、分离操作条件的选择 choice of chromatographic operating condition 五、固定相与流动相 stationary phases and mobile phase in HPLC 六、高效液相色谱法的应用 application technology of gas chromatograph 一、概述 1、定义： 高效液相色谱法（performance liquid chromatography）又称高压液相色谱法：是以高压输出的液体为流动相的色谱技术。 2、发展 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。 它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。 3、高效液相色谱法的特点： （1）与经典的液相色谱法比较： 高效：使用了极细颗粒的固定相和均匀填充技术，每米可达105理论塔板数； 高速：采用高压输液泵输送流动相，流速加快，一次分析只需几分钟到几十分钟。 高灵敏度：紫外，荧光，电化学以及质谱等技术作为检测器，最低检出限可达10-9~10-17g。 高自动化：智能化色谱专家系统和自动进样装置的结合，整个过程完全实现自动化，更缩短了分析时间。 3、高效液相色谱法的特点： （2）与气相色谱法比较： 应用范围广：样品不受沸点和热稳定性的限制，只要能制成溶液。 选择性高：流动相参与分配作用，流动相的极性、pH值等对分离效果影响非常大，还可以往流动相里添加一定的添加剂完成特殊的分离分析， 温度对分离影响不大，通常采用室温。 馏分易于回收，可以用作制备色谱。 (3)主要缺点：仪器昂贵，缺乏通用性的检测器，流动相消耗成本高，对环境污染比较严重，危害人体健康。 4、高效液相色谱法的分类： （1）按固定相的物理状态分： 液固色谱—固定相为固体； 液液分配色谱 —固定相为液体； （2） 按分离原理分： 液固吸附色谱；液液分配色谱；离子交换色谱；尺寸排阻色谱； 化学键合相色谱；手性色谱；亲合色谱；胶束色谱； 高效毛细管电泳法；区带毛细管电泳法；胶束毛细管电泳法； （3）按流动相的极性大小分： 正相色谱：极性固定相； 反相色谱 ：非极性固定相 二、高效液色谱仪器 high performance liquid chromatograph 2、流程 process of HPLC 3.主要部件main assembly of HPLC 过滤装置 溶剂过滤器 过滤装置 高压输液泵 高压输液泵的作用： 提供足够恒定的压力，使流动相以稳定的流速流经整个色谱系统 对高压泵的要求： 1）密封性好，耐腐蚀。 2）有足够的输出压力，30～50MPa； 3）输出流量恒定，其流量精度﹤1%；范围可调。 4）压力平稳，无脉动； 5）泵室体积小（ ﹤0.5ml ），易清洗，便于迅速更换流动相。 高压泵的分类： 1）恒压泵 分类：液压隔膜泵和气动放大泵。 特点：恒压但不恒流。 应用：匀浆装柱。 2 ）恒流泵 分类：螺旋注射泵和柱塞往复泵。 特点：恒流；受流动相性质影响小。 应用：分析。 梯度淋洗装置 (2) 进样装置 六通阀 (3) 高效分离柱 材料：不锈钢柱，内壁需要高度光洁。 柱规格： 常量柱: ?=2.0～4.6mm, L=10～25cm 半微量柱：?=1.0～1.5mm, L=10～20cm 毛细管柱： ?=0.5～1.0mm, L=30～75cm 实验室制备柱：?= 20～40mm, L=10～30cm 高效液相色谱柱 色谱柱的保护 流动相和样品预先过滤； 控制流动相的pH值在柱子允许的范围内，一般为3~8； 防止流动相互不相溶而使盐在色谱柱中析出堵塞色谱柱； 实验完毕，选用适当的溶剂冲洗柱子，避免长时间不用由于溶剂挥发造成盐析，或者滋生细菌堵塞色谱柱。 可以在分析柱前加一个短的保护柱（预柱）。 (4) 液相色谱检测器 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。 总体检测器（通用性检测器）： 它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应。 示差折光，电导检测器等。不能用于梯度洗脱。 溶质性检测器（专属性检测器）： 它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应。 紫外、荧光、化学发光、电化学检测器等