生化工艺——第四章沉淀.ppt

第四章 沉淀技术 第一节 蛋白质沉淀的基本原理 第二节 蛋白质沉淀技术实施 学习目标 了解蛋白质的基本性质； 掌握蛋白质沉淀的基本原理； 掌握沉淀技术的基本方法； 能够正确进行蛋白质的沉淀分离操作，并能分析影响沉淀的有关因素。 沉淀的定义 沉淀技术的特点及适用范围 第一节 蛋白质沉淀的基本原理蛋白质表面特性－蛋白质组成 影响蛋白质溶解度的主要因素 二、蛋白质胶体溶液的稳定性胶体的定义 胶体是一种尺寸在1～100 nm以至1000 nm的分散体。它既非大块固体，又不是分子分散的液体，而是具有两相的微不均匀分散体系。 -《被遗忘了尺寸的世界》 胶体的性质 布朗运动 丁达尔现象 电泳现象 粘度大 不能透过半透膜的性质等。 蛋白质表面特性－蛋白质性质 蛋白质的胶体性质 蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质的变性 蛋白质表面特性－沉淀屏障 蛋白质分子周围的水化层 分子间的静电排斥作用-双电层 蛋白质表面特性－沉淀策略及方法 策略 破坏蛋白质四周水化层 降低双电层厚度 沉淀方法 改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂 蛋白质表面特性－常用的沉淀技术 盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性变性沉淀 等电点沉淀 聚合物沉淀 聚电解质沉淀 金属离子沉淀 第二节蛋白质沉淀技术的实施一、盐析沉淀 定义 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析（Salting-out） 溶解度与I的关系－Cohn经验方程 盐析沉淀-盐析原理 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现两种情况： （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 原因? （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降 原因? 盐析沉淀-盐析原理图示 盐析沉淀的影响因素1、无机盐的种类和浓度 无机盐的选择 结论： a 不同种类的盐主要影响盐析常数Ks； b 离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。 盐析沉淀的影响因素 盐析沉淀的影响因素 3、溶液pH pH影响Cohnx方程中的?值。 见图 盐析沉淀的影响因素 4、温度 在低离子强度溶液中，蛋白质的溶解度在一定的温度范围内随着温度升高而增大 在高离子强度溶液中，温度的升高利于蛋白质脱水，破坏水化层,导致蛋白质溶解度的降低 低温（0-4 ℃）避免失活 盐析操作-溶解度曲线确定 二、有机溶剂沉淀1、原理 有机溶剂沉淀-原理图示 2、特点 优点 分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀 有机溶剂密度较低，易于沉淀分离 与盐析沉淀相比，沉淀产物不需脱盐 缺点 易引起蛋白质变性失活，操作需在低温下进行 试剂易燃，有毒。 耗用大量溶剂，而溶剂来源、贮存都比较困难麻烦； 三、选择性变性沉淀 利用蛋白质、酶、核酸等生物大分子对某种物理或化学因素的敏感性差异，实现分离。 选择性热变性（使用时需慎重！！！！） 加入表面活性剂 选择性酸碱变性 热变性沉淀（Thermal precipitation) 定义：利用在较高温度下，热稳定性差的蛋白质发生变性沉淀的现象，分离纯化热稳定性高的目标蛋白的方法。 操作条件： 调节pH； 加入有机溶剂。 特点： 是一种变性分离法，带有冒险性，需对目标蛋白和共存杂蛋白的热稳定性有充分了解。 加入离子型表面活性剂 十六烷基三甲基季铵盐的溴化物（CTAB） 主要用于沉淀酸性多糖 十二烷基磺酸钠（SDS） 主要用于沉淀膜蛋白和核蛋白 选择性酸碱变性 利用蛋白质和酶等在不同pH值条件下的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤。 四、等电点沉淀1、定义 2、等电点沉淀-沉淀条件 较低的溶液离子强度 溶液的pH值接近等电点 3、等电点沉淀-操作特点 无需脱盐 结合使用 调节方便 五、 有机（非离子型）聚合物沉淀法 某些聚合物，如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等，具有沉淀蛋白质的作用。其中最常用的是PEG，相对分子质量从200D到20KD的不同聚合程度的产品都是有效的，通常在蛋白质沉淀中使用PEG-6000或PEG-4000。 特点 优点： A、体系的温度只需控制在室温条件下； B、沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集； C、PEG非但不会使pro变性,而且可以提高它的稳定性； D、PEG无毒，优先使用在临床产品的加工过程中被。 缺点： A、PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此需用超滤和液-液萃取来解决； B