第三章离心分离技术.pptVIP

离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的技术。 2．密度梯度离心 密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使密度不同的组分得以分离的一种区带分离方法。 密度梯度系统是在溶剂中加入一定的梯度介质制成的。梯度介质应有足够大的溶解度，以形成所需的密度。 常用的有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统，其梯度范围是：蔗糖浓度5％～60％，密度1.02～1.30g/cm3。 密度梯度的制备可采用梯度混合器，也可将不同浓度的蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，越靠管底，浓度越高，形成阶梯梯度。 离心前，把样品小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面。离心后，不同大小、不同形状、有一定的沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带，各区带内的颗粒较均一，分离效果较好。 在密度梯度离心过程中，区带的位置和宽度随离心时间的不同而改变。随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此，适当增大离心力而缩短离心时间，可以减少区带扩宽。 离心分离的效果好坏与诸多因素有关。除了上述的离心机种类、离心方法、离心介质及密度梯度等以外，主要的是确定离心机的转速和离心时间，此外还要注意离心介质溶液的pH值和温度等条件。 代入上式，得到： αc =ω2r =4π2n2r /3600 式中 n：转子每分钟转数(r／min)。 在说明离心条件时，低速离心通常以转子每分钟的转数表示，如4000 r／min；而在高速离心时，特别是在超速离心时，往往用相对离心力来表示，如：65，000g。 由此可见，离心力的大小与转速的平方及与旋转半径成正比。在转速一定的条件下，颗粒离轴心越远，其所受的离心力越大。在离心过程中，随着颗粒在离心管中移动，其所受的离心力也随着变化。 在实际工作中，离心力的数据是指其平均值。即是指在离心溶液中点处颗粒所受的离心力。 2．离心时间 离心时间的概念依据离心方法的不同而有所差别。 对于差速离心来说，是指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间。 对等密度梯度离心而言，离心时间是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间。 密度梯度离心的时间则是指形成界限分明的区带的时间。 密度梯度离心和等密度梯度离心所需的区带形成时间或平衡时间，影响因素很复杂，可通过试验来确定。差速离心所需的沉降时间可通过计算求得。 颗粒的沉降时间是指颗粒从离心样品液液面完全沉降到离心管底所需的时间，又称澄清时间。沉降时间取决于颗粒沉降速度和沉降距离。 对于已知沉降系数的颗粒，其沉降时间可由下列公式计算： t=（1/s）×（lnr2一lnr1）/ω2 式中t：沉降时间(s)；S：颗粒的沉降系数(1×10-13 S)；ω：转子角速度(rad／s)；rl，r2：分别为旋转轴中心到样品液液面和离心管底的距离(cm)。 上式中括号部分对特定转子为一常数，称转子效率因子或K值。即 K=（lnr2一lnr1）/ω2=St 转子的效率因子K与转子的半径和转速有关。生产厂家已在转子出厂时标出了最大转速时的K值，由此可以根据ω2K1=ω2K2算出其他转速时的K值。 对于具有某一沉降系数S的颗粒来说，K值越小，其沉降时间越短，转子的使用效率就越高。 在离心机及其转子选定后，rl和r2不变。对于某种物质颗粒(S确定)的沉降起决定作用的是转子的转速ω以及沉降时间t。 操作时可采用较低的转速，离心较长的时间；或采用较高的转速，离心较短的时间，而得到相同的ω2t。 例如：用10 000 r／min离心10 min，计算得 ω2t=(2πn/60)2t=6.5785×108(S-1) 如果用5000 r／min的转速离心40 min，ω2t值为6.5766×108(S-1)，两者基本相等。 4.分析性离心机 分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程，从而确定其物理性质。 利用特殊配置的数据处理机自动计算s(沉降系数)和Mr。主要用于生物大分子的相对分子质量测定，估价样品纯度和检测生物大分子构象的变化等。主要产品有美国Beckman公司的Model E及日本日立公司的282型。 分析性超速离心机的转头是椭圆形的，以避免应力集中于孔处。转头通过一个有柔性的轴联接到高速的驱动装置上，转头在低温和真空的腔室中旋转，转头上有2-6个装离心杯的小室，离心杯是扇形石英的，可以上下透光，离心机中装有光学系统，在整个离心期间都能通过紫外吸收或折射率的变化监测离心杯中沉降着的物质，在预定的期间可以拍摄沉降物质的照片，