干预肿瘤Rb基因激活的新靶点及机制研究.docxVIP

华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 材料和方法 1．试验材料 1．1细胞来源 MKN-28细胞株为人类胃癌细胞，由本实验室传代培养。 1．2标本收集 收集武汉市同济医院胃肠外科2004．11-2005．1间20例胃肠道恶性肿瘤患者的手术切除标本(腺癌，胃癌6例，结肠癌5例，直肠癌9例)，每例包括癌组织、癌旁黏膜(距癌边缘5cm以内)、正常组织黏膜(切除标本的远端边缘组织)三种组织。 1．3主要试剂 (1)DMEM培养液 (2)胎牛血清(Gibco公司) (3)胰蛋白酶 (4)兔抗P557P13K多克隆抗体(美国马里兰大学Greenebaum肿瘤中心夏献民博士惠赠) (5)鼠抗Rb单克隆抗体(购自BD Biosciences公司) (6)蛋白A(Protein A-Sepharose，购自Pharmacia) (7)蛋白分子量标准(Marker,购白Fermentas) 1．4仪器与器材 低温高速离心机 台式离心机 超净工作台 恒温C02细胞培养箱 细胞记数板 匀浆器 恒温水浴箱 一70℃低温冰箱 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 全套聚丙烯酰胺凝胶电泳装置(Bio．Rad公司) 室温摇床 2．实验方法 2．1试剂的配制 (1)蛋白酶抑制剂： 1mM PMSF，1ug／ml Aprotinin，1ug／ml Leupeptin，1ug／ml Pepstnin，用乙醇配制，放入一20。C冰箱保存。 (2)组织裂解液Lysis Buffer(modified RIPA buffer)= 称取氯化钠1．169克， Tris—base 0．242克，TritonX一100 2ml，EDTA 0．074克，十二烷基磺酸钠(SDS) 0．2克，甘油20ml，氟化钠0．008克，钒酸钠0．16克，脱氧胆酸钠1．0克，EGTA0．076 克，焦磷酸钠1．784克，加入双蒸水190ml，并调PH值7．4，最后定容至200ml， 放入4℃冰箱保存，l临用前加入蛋白酶抑制剂。 (3)2xSDS加样缓冲液：4xTris-CI／SDS(PH6．8)25ml， SDS 4克，甘油20ml， 加双蒸水至100ml。 (4)1xSDS细胞裂解液：2xSDS加样缓冲液50ul，Is-巯基乙醇(ME)2ul，蛋白 酶抑制剂1ul，加双蒸水至100ul，临用前配制。 (5)PH 8．8的Tris-CI：称取Tris-base 45．412克，0．4％SDS 1克，调PH值8．8， 加入双蒸水至250ml。4。C保存。 (6)12％分离胶缓冲液：30％丙烯酰胺3ml，4xTris·CI／SDS(PH 8．8)1．875m，双蒸 水2．625ml，10％过硫酸铵0．025ml，TEMED 0．005ml。 (7)PH 6．8的Tris—CI：称取Tris．base 6．055克，0．4％SDS 0．4克，调PH值6．8，加入双蒸水至100ml。4。C保存。 (8)积层胶缓冲液：300／0丙烯酰胺0．65ml，4xTris·CI／SDS(PH 6．8)1．25ml，双蒸水3．05ml，100／0过硫酸铵0．025ml，TEMED 0．005ml。 (9)5×电泳缓冲液： 称取Tris．base 15．1克，甘氨酸72克，SDS 5克，加入双蒸水至1000ml。室温保存。 (10)转膜缓冲液： I ris—base 3．034克， 甘氨酸14．416克， 甲醇200ml，加 双蒸水至1000ml，4℃冰箱保存。 (11)洗膜缓冲液(TBST)：2M Tris—base(PH7．5)5ml，5M NaCI 15ml，Tween．20 6 华中科技大学同济医学院 硕士学位论文 250ul，加双蒸水至500ml，室温放置备用。 (12)5％脱脂牛奶：称取脱脂奶粉1克，加入TBST 20ml，配好后放入4。C冰箱保存。 (13)DAB显色液：Tris·CI(PH7．5)5ml，5％DAB 100ul，30％H202 10ul，加入双蒸水至10ml，临用前配制。 (14)考马斯亮蓝G250．- 称取考马斯亮蓝G250 50毫克，取95％乙醇25ml，磷酸50ml，加双蒸水至500ml。 (15)70％乙醇： 取无水乙醇70ml，加入双蒸水30ml，混匀，放于一20。C冰箱中保存。 (16)PBS缓冲液：称取氯化钠4克，氯化钾0．1克，十二水磷酸氢二钠1．439克，磷酸氢二钾0．12克溶于500ml双蒸水中，室温保存。 2．2细胞培养和处理 (1)细胞培养：人胃癌细胞株MKN一28加入含10％胎牛血清和抗生素(青霉素10万 U／L及链霉素100mg／L)的DMEM培养基中，置于37。C恒温C02细胞培养箱中培养， 取对数生长期细胞用O．25％的胰蛋白酶消化，离心去培养基，用P