黄曲霉毒素的检测方法研究进展.docVIP

黄曲霉毒素的检测方法研究进展(综述) 刘作新 ，高军侠 (1．中国科学院沈阳应用生态研究所，沈阳110016；2．中国科学院研究生院，北京100039) 摘要：黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是一类有毒致癌化合物，污染粮食及其制品，给人类健康造成严重威胁。本文对目前用于黄曲霉毒素的检测方法进行了综述。在对薄层层析法、高效液相色谱法、微柱法及酶联免疫吸附法等检测方法综合分析的基础上，评述了上述方法的优劣和适用条件。 关键词：黄曲霉毒素；检测方法；进展 黄曲霉毒素(aflatoxin，AFT )主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物。在世界不同地区都发现了这些真菌大量存在于供人类食用的食品中，黄曲霉毒素污染已导致严重的食品安全问题[1,2] 。自20世纪60年代以来，有关黄曲霉毒素的危害被大量报道，以致黄曲霉毒素已成为最受人们关注的一种真菌毒素 [3]。因此，寻求准确、快速、简便的检测方法，对黄曲霉毒素进行高效的定性定量分析，是黄曲霉毒素研究的一个重要方面。 1.黄曲霉毒素研究概况 迄今为止，已经发现的黄曲霉毒素至少包含黄曲霉毒素B1、B 2、G1、G2 、M1、M2 等l7种结构相似且特征已知的化合物，其结构特征为都含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮。黄曲霉毒素的理化性质比较稳定，如B1 在高温200℃、紫外线照射下，都不能使之破坏，加热到B1的熔点(268～269~C)才开始分解；在酸性溶液中，B1也很稳定，在pH 1～3的强酸性溶液中则稍有分解【2】 。黄曲霉毒素的毒性为氰化钾的l0倍，砒霜的68倍，能引起人急性中毒死亡，与人的肝癌有密切关系，能使家畜、家禽及多种实验动物诱发癌症，其中B1、B2 、G1、G2 是最主要的毒素物质，而B1是自然发生潜力最大的一种毒素【4,5】 。 2 黄曲霉毒素的检测方法 黄曲霉毒素的检测方法从最初以薄层层析法为主，发展到高效液相色谱法、微柱法、酶联免疫吸附法等多种方法普遍应用，其进展与新的化学检测手段和新仪器的出现密不可分。这些新方法、新手段的快速应用，为黄曲霉毒素的检测提供了更广泛的选择余地，适应了不同的检测目的和要求[6]. 2．1 薄层层析法(TLC) 薄层层析法是测定黄曲霉毒素的经典方法，其原理是将样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层分离后，在波长365 nm紫外光下产生蓝紫色或黄绿色荧光，并根据其在薄层上显示的最低检出量来确定其含量。 聂孝同等【7】 应用薄层层析法采用以下步骤对饲料中的黄曲霉毒素进行了检测。首先是黄曲霉毒素的提取：把粉碎过20目筛的样品放人具塞三角瓶中，加入甲醇(55：45)溶液，再加入石油醚盖严，静置片刻后，用慢速定量滤纸过滤于分液漏斗中，通人三氯甲烷，再过滤并将滤液在65℃水浴上通风挥干，冷却后加入苯一乙腈(98：2)充分混合，然后吸取上清液待用。对杂质少的样品，采取直板定性。依次点板、展开、观察；其中预展展开剂为无水乙醚，正展展开剂为丙酮一三氯甲烷(1：9)，且展开剂要事先加入到展开槽内；通过观察，无荧光出现为阴性．出现荧光则为阳性，需作直板确证，若继续有荧光出现，则进一步作定量确证；样品的某一点荧光强度与标样点的荧光强度相一致，则取此点为样本的黄曲霉毒素含量值，否则作稀释定量检测；但是对于杂质多的样品，须采取横板定性；同样经过点板、展开、观察，有荧光者为阳性检出，进一步作横向确证，经再次检测观察呈阳性，则需要定量确证黄曲霉毒素含量。 为了提高薄层层析法的精度，建立薄层扫描法来测定黄曲霉毒素，它是薄层层析法的仪器化，样品的处理和层析条件与薄层层析法相同，只是在标准品的设定和结果判定上有所不同。杨焱等【8】 把粉碎过筛的样品加水湿润后通人氯仿过滤，取滤液在65℃水浴上挥干，再用苯一乙脯溶液转移；通过点板，用乙醚预展后，再用氯仿一丙酮(92：8)展开，在365 nm紫外光下观察，根据AFB1、AFB2 、AFG1和AFG2分别显示的蓝紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光，在扫描仪上绘制AFT扫描图谱，并由此分辨出黄曲霉毒素种类；最后作定量分析：以斑点面积积分值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，得到样品的黄曲霉毒素浓度。 2．2 高效液相色谱法(HPLC) 用高效液相色谱法测定黄曲霉毒素，一般分提取、净化、衍生和测定几个步骤。 提取通常是黄曲霉毒素分析的第一步，所用的仪器和溶剂有很多种 [2,9]韩红岩等 [10]对于受黄曲霉毒素污染不同程度的玉米用60％甲醇、80％丙酮、90％ 乙腈提取，均得到较高的回收率，其中，80％丙酮的毒性与乙腈、甲醇相比较小，操作较为安全，是提取黄曲霉毒素的最佳选择；王光建等 [11]给样品中加入甲醇(6：4)溶液，高速捣碎，将提取物于离心管离心5～10 min后，给上清液中加入氢氧化铁悬浮液搅匀