灭菌与消毒指示器材鉴定试验.docx

灭菌与消毒指示器材鉴定试验 2.1.6.1 压力蒸汽灭菌生物指示物鉴定试验 2.1.6.1.1 目? 的 测定压力蒸汽灭菌生物指示物所含菌量，以及在121℃±0.5℃饱和蒸汽作用下的存活时间、杀灭时间与 D 值是否达到要求指标。 2.1.6.1.2? 实验器材 (1) 压力蒸汽灭菌生物指示器材抗力检测器 (biological indicator evaluator resistometer，pressured steam sterilization，BIER，下简称抗力检测器)。对抗力检测器要求的技术指标：时间控制以秒为单位；温度控制以0.1℃为单位；加热至预定温度的时间应≤10s；排气时间≤5s；试验期间柜室内温度误差≤±0.5℃。 (2) 56℃～60℃ 温箱。 (3) 溴甲酚紫蛋白胨培养液 (嗜热脂肪杆菌芽胞恢复培养基，见附录A)。 (4) 嗜热脂肪杆菌芽胞恢复琼脂培养基 (见附录A)。 (5) 眼科镊子 (夹取菌片用)。 (6) 磷酸盐缓冲液 (PBS，0.03 mol/L，pH 7.2)。 (7) 回收液 (含 0.1% 吐温 80 的 PBS 液)。 2.1.6.1.3 生物指示物微生物含量与抗力标准 (1) 嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus ATCC 7953或SSI K31) 芽孢。回收菌量为5×105cfu/片～5×106cfu/片，或5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。 (2) 在121℃±0.5℃ 饱和蒸汽条件下，存活时间≥3.9min，杀灭时间≤19min。 (3) 在121℃±0.5℃ 饱和蒸汽条件下，D值为1.3min～1.9min。 2.1.6.1.4? 生物指示物含菌量的测定 随机抽取3个生物指示物样本。样本如为菌悬液式指示物，直接用 PBS 作适当稀释后，按2.1.1.3 规定进行活菌培养计数即可；样本如为含菌载体式指示物 (如菌片)，应先置回收液中洗下芽孢，并以PBS稀释至适当浓度，再进行活菌计数培养。培养温度为56℃～60℃，24h 观察结果。培养基仍用营养琼脂培养基。检测菌量符合2.1.6.1.3者为合格。 2.1.6.1.5 存活时间和杀灭时间的测定 下以生物指示管的测定为例： (1) 试验按作用时间分为 3.9min 和 19min 两组，各组测定20个样本。 (2) 先将抗力检测器的电热蒸汽发生器加满蒸馏水，以不超过最高水位为度。 (3) 接通检测器电源，预热，使达到预定蒸汽压。 (4) 设定灭菌温度(121℃±0.5℃)和作用时间。 (5) 启动抗力检测器工作程序，使自动运行两个循环，以保证柜室等得到充分的预热。 (6) 将生物指示管 (每批放 20个样本) 放专用载物架上并置抗力检测器柜室中，保证每个样本都可充分暴露于蒸汽中。 (7) 关闭柜门，先设定一组所规定的灭菌时间。 (8) 启动抗力检测器工作程序，使自动进行抽真空→柜室加热→灭菌处理→排气。 (9) 打开柜门，取出生物指示管。 (10) 紧接着重复 (5)～(9) 的程序进行另一组的测定。 (11) 取出的生物指示管应尽快 (勿超过 2h) 放入 56℃～60℃ 温箱，培养 7d，观察最终结果。 (12) 测定结果，3.9min 组(存活时间组)20个生物指示管均有菌生长；19min 组(杀灭时间组)20个生物指示管均无菌生长时，可判为合格。其中一个组或两组各有一个样本未达规定要求，可再用4组样本重复试验(3.9min和19min组各测试2次)。重复试验中，如各样本均达规定要求，仍可认为合格。 [ 对生物指示菌片测定时，操作程序与判断标准与上述生物指示管基本相同，只是将单片菌片装于牛皮纸袋中，以防灭菌时被冷凝水浸湿。此外灭菌完毕，需将样本分别接种于溴甲酚紫蛋白胨培养液中培养，7d 观察最终结果]。 2.1.6.1.6? D 值的测定 (1) 随机抽取 50个样本，在 0min～20min 范围内分成 10个作用时间组进行试验。每组 5个样本。作用时间递增幅度，可根据预备试验结果适当变动(最长时间必须达到使菌全部死亡的作用时间)。 (2) 将各组样本按 2.1.6.1.5 (2)～(10) 所示程序，分次进行灭菌处理。 (3) 灭菌完毕，按 2.1.6.1.4 所示对各组样本随机抽取3个进行活菌培养计数。 (4) 计算每个作用时间样本上平均存活芽孢数的对数值。以作用时间为横坐标(X)，存活芽孢数的对数值为纵坐标(Y)，算出芽孢存活与作用时间的回归方程(Y = a + bX)。 (5) 计算各实际测定值与直线回归方程的相关程度(相关系数)。 (6) 根据所得直线回归方程式，计算出减少90%芽孢数所需的作用时间(D 值)。D值符合2.1.6.1.3 者为合格。 2.1.6.1