病毒灭活试验.docx

病毒灭活试验 2.1.1.10.1 适用范围 主要适用于消毒产品鉴定或日常监测。用具有一定代表性的、活的病毒及其细胞感染技 术，评价各种用途的消毒因子对测试病毒的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒因子的灭活病毒能力的重要方面进行验证。 2.1.1.10.2 试验器材 （1）试验用病毒株：脊髓灰质炎病毒1型（poliovirus-Ⅰ，PV-Ⅰ）疫苗株；艾滋病病毒 1 型（HIV-1）美国株。 （2）宿主细胞：可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL细胞系，作为PV-1的测试细胞。用含有人T 淋巴细胞白血病病毒 1 型（human T cell leukemiavirus 1，HTLV-1）基因的人淋巴细胞（MT4 株）作为HIV-1的测试细胞。 （3）细胞培养瓶与 96 孔培养板。 （4）恒温水浴箱。 （5）二氧化碳培养箱。 （6）层流超净工作台。 （7）低温冰箱（-20℃，-80℃）。 （8）液氮罐。 （9）倒置显微镜。 （10）离心机。 （11）可调移液器及配套一次性塑料吸头。 （12）细胞维持培养基：见附录A。 （13）细胞完全培养基：见附录A。 （14）去离子水。 2.1.1.10.3 病毒悬液的制备 （1）从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀，立即离心（3000r/min，3min），去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有10ml完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。 （2）取出低温冻存的试验病毒毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。 （3）将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波（或反复冻融）破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心（6000r/min，15min）去除沉淀（主要为细胞碎片），上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.0ml分装于无菌离心管(1.5ml)中。 （4）取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余均冷冻保存于-80℃备用。 2.1.1.10.4 病毒灭活滴度计算方法 （1）终点稀释法病毒感染滴度的计算 以半数细胞感染剂量（TCID50）表示。TCID50的对数值计算公式如下。 TCID50 对数值= 病变率高于50%组稀释度的对数值 + 距离比例 （“病变率高于 50% 组”是指病变率超过50%的最低组，下简称“高于 50% 组”；“病变率低于50%组”是指病变率低于50%的最高组，下简称“低于50%组”）。 具体计算方法如下： 1）计算细胞病变率。先计数培养板上不同稀释度样本细胞病变发生与未发生的孔数，然后分别计算“细胞病变（-）”和“细胞病变（+）”的累积总计值。计算“细胞病变（-）”累积值时，由稀释度低样本组向稀释度高样本组累积；“细胞病变（+）”累积值则相反，由稀释度高样本组向稀释度低样本组累积〔见表 2-2〕。 各稀释度样本组“细胞病变（+）”累积总计值，除以该稀释度样本组“细胞病变（-）”与“细胞病变（+）”累积总计值之和即为其病变比，由之可得病变率（%）〔见表 2-2〕。 2）计算距离比例。距离比例可按下式计算： ? ? 3）计算举例 设试验数据如表 2-2 表 2-2? 某消毒剂对 HIV 灭活作用的测定结果 样本 接种 细胞病变 累积值 病变比 病变率（%） 稀释度 孔数 - + 细胞病变(-) 细胞病变(+) 10-4 4 0 4 0 12 12/12 100 10-5 4 0 4 0 8 8/8 100 10-6 4 1 3 1 4 4/5 80 10-7 4 3 1 4 1 1/5 20 10-8 4 4 0 8 0 0/8 0 本例，高于 50% 组病变率（%）为80；低于50%病变率（%）为20；高于50%组稀释度对数值为6。 ? TCID50 对数值 = 6＋0.5 = 6.5 （2）噬斑法病毒感染滴度的计算 噬斑法病毒感染滴度，以噬斑形成单位数（pfu），简称噬斑数表示。计数方法同活菌培养计数技术（参见2.1.1.3）。 每毫升测试样品中的病毒含量计算（pfu/ml）＝ 平板平均噬斑数×稀释倍数 （3）平均灭活对数值的计算 平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）为Nx。 平均灭活对数值 = log No－log Nx