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细胞外辅酶I抑制人类中性粒细胞凋亡 Extracellular NAD+ inhibits human neutrophil apoptosis Boris K. Pliyev ? Anna V. Ivanova ? Valery G. Savchenko Hematology Research Center Novy Zykovsky Pr. 4 Moscow 125167 Russia Institute of Immunology Kashirskoye Shosse 24-2 Moscow 115478 Russia 摘要 中性粒细胞凋亡的调节在炎症反应中起着关键作用。炎症先前已被证明会增加细胞外烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的水平。当前研究表明在发炎组织中发现的浓度的细胞外NAD+严重延迟了人类嗜中性粒细胞的自发凋亡其主要机理是被证实通过抑制磷脂酰丝氨酸(PS)暴露、DNA分裂和caspase-3活化来起作用。该效应可以被P2Y11受体的拮抗剂NF157终止但对百日虫毒素却不敏感。由NAD+介导的中微粒细胞凋亡延迟，可以被2’ 5’-二氧腺苷(一种腺苷环酶抑制剂)和Rp-8-Br-cAMPS(I型cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)的抑制剂逆转。阻止NAD+引起的细胞外Ca2+与EGTA的流入并没有消除NAD+的促生存效应。细胞外NAD+抑制了半胱氨酸蛋白酶活化的上游，蛋白酶体依赖的Mcl-1的降解此外抑制了Bax对线粒体的易位并减轻了线粒体跨膜电位(DWm)的耗散和细胞色素c从线粒体释放到细胞质中。最后我们发现细胞外NAD+抑制了半胱氨酸蛋白酶-9的自发激活而不是半胱氨酸蛋白酶-8的自发激活细胞外NAD+的促生存效应被半胱氨酸蛋白酶-9抑制剂所终止而不是通过半胱氨酸蛋白酶-8的抑制剂。这些结果共同证明细胞外NAD+通过P2Y11受体和cAMP/PKA通路抑制中性粒细胞凋亡通过调节Mcl-1水平调节靶向结合在线粒体的Bax以及线粒体凋亡通路。因此细胞外NAD+扮演着中性粒细胞生存因子在炎性反应中的中性粒细胞寿命延长起到重要的作用。 关键词 细胞外辅酶I(NAD+)、嗜中性粒细胞凋亡、cAMP 结果 细胞外NAD+通过P2Y11受体抑制中性粒细胞凋亡. 在图1ab显示在微摩尔浓度下细胞外NAD+以剂量依赖性的方式深刻地抑制了PS暴露和DNA分裂。数据代表18h培养的中性粒细胞凋亡但细胞外NAD+在6、12和24-h培养中也产生了促进生存效应(图1c)。在NAD+浓度低至1μM时观察到半最大效应(图1)。值得注意的是在炎症组织中检测到的NAD+浓度(约10μM)观察到最大的亲生存效应。NAD+的形式在抑制中性粒细胞凋亡方面与b形式一样有效而NADH(浓度高达100μM)没有产生显著效果。  图1 中性粒细胞中的凋亡信号通路已被证明在嗜中性粒细胞的主要效应者半胱氨酸蛋白酶-3的活化上收敛。因此我们检查了是否细胞外NAD+影响半胱氨酸蛋白酶-3的自发激活。通过监测标有p-硝基尼利化物的肽DEVD的裂解以色谱测定内源性中性粒细胞-3活性。此外通过检测蛋白质印块(图2b)对有源的半胱氨酸蛋白酶-3(17和19kDa)的激活性进行了分析。图2ab显示在新鲜分离的嗜中性粒细胞中半胱氨酸蛋白酶-3活性几乎无法检测到但在培养为18小时中的嗜中性粒细胞中显著增加。培养细胞中的半胱氨酸蛋白酶-3活性显著降低(图2ab)。 图2细胞外NAD+抑制半胱氨酸蛋白酶-3活化。中性粒细胞在10μM NAD+或无10μM NAD+中孵育为18小时。半胱氨酸蛋白酶-3活性通过材料和方法部分所述的色度测定进行分析。结果表示为相对半胱氨酸蛋白酶-3活性在无NAD培养的细胞中半胱氨酸蛋白酶-3活性表示为100%。 先前的研究表明P2Y11纯化受体介导细胞外NAD+诱导的嗜中性粒细胞活化和化疗。图3a显示NF157废除了中性粒细胞凋亡的细胞外NAD+介导延迟但对自发性中性粒细胞凋亡没有影响。NF157的抑制作用在高浓度的细胞外NAD+下被克服符合其P2Y11对抗的竞争性质(图3a)。事实上细胞外NAD+的亲生存效应是百日增毒素不敏感(图3b)。相比之下百日虫毒素完全阻断了通过Gi耦合受体作用的白细胞原B4(LTB4)的亲生存效应(图3b)。 图3细胞外NAD+以百日虫毒素不敏感的方式通过P2Y11受体延迟中性粒细胞凋亡。 细胞外NAD+通过cAMP/PKA途径抑制中性粒细胞凋亡 事实上细胞外NAD+未能抑制用Rp-8-Br-cAMPS预处理的嗜中性粒细胞凋亡(图4a)。这些结果表明细胞外NAD+通过cAMP/PKA通路抑制中性粒细胞凋亡。 细胞外信号调节激酶(ERK)、磷脂酰二醇3-激酶(PI3K)/Akt和p38激酶信号通路已证明在调节中性粒细胞生存和调解中