第2章细胞培养2.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 培养细胞的遗传学特征 1.染色质与染色体 原代培养多呈二倍体 长期传代发生偏离二倍体现象 2.细胞性别 Barr小体 Y小体 体内外细胞的差异及培养细胞的分化 体内外细胞的差异 培养细胞的分化 细胞培养液 常用液体 1.水 2.平衡盐溶液 3.消化液 4.消化酶抑制液 5.pH调整液 平衡盐水BSS 用途: 作为培养基的基础液 洗涤组织、细胞等 成分： 无机盐 葡萄糖 作用： 维持渗透压，调节pH， 供给能量和无机离子 常用:Hanks液 Earle液 PBS 配制要求:防止钙沉淀 良好的缓冲作用 细胞消化液: 胰蛋白酶(trypsin)溶液 浓度——0.125%和0.25% 最适条件——pH8.0　　37 ℃ 配制——无Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液 　　Versen液，常用浓度0.02％ 其他：链霉蛋白酶，骨胶原酶，透明质酸酶 消化酶抑制液 大豆胰酶抑制液 终浓度：0.1% ~ 0.5% 常以DMEM/F12培养液配制 过滤除菌 -20 ℃保存 pH调整液 3.7％，5.6％，7.4％NaHCO3溶液 0.22μm滤膜过滤除菌 NaHCO3+H2O Na++OH-+ H2O+CO2 HEPES 0.22μm滤膜过滤除菌 抗生素溶液： 青、链霉素(双抗) 　　青霉素——抑制细菌细胞壁的合成　100U/ml 　　链霉素——抑制细菌蛋白质的合成 100μg/ml 卡那霉素 制霉菌素　 谷氨酰胺补充液 溶液中不稳定 过滤除菌 -20 ℃保存 培养基——天然培养基、合成培养基 营养成分： 氨基酸：L型 单糖：葡萄糖 维生素 其他成分 ：核酸降解物、抗氧化剂等 促生长因子及激素 pH 渗透压 天然培养基 血清 组织提取液 鸡胚汁 鼠尾胶原 水解乳蛋白 血清 种类: 小牛血清 牛血清： 新生牛血清 胎牛血清 马血清 鸡血清 兔血清 羊血清 主要成分： 各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。 血清的主要作用： 提供基本营养物质 提供贴壁和扩展因子 提供激素和各种生长因子 提供结合蛋白 对培养中的细胞提供某些保护作用 使用血清的缺点： 可能改变某种细胞在体内的正常状态。 取材过程有可能带入支原体、病毒，对培养的细胞 产生潜在影响，可能导致实验失败或实验 结果的不 可靠性 每批血清之间都有差别，其成分不能保持一致 血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用 血清的质量标准 理化性质（渗透压、pH、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等） 微生物检测（细菌、真菌、支原体、病毒等） 促生长效果 血清的使用与储存 使用前处理： 灭活处理——56℃，30min 目的——去除血清中的补体成分，避免补体 对细胞产生细胞毒作用 储存条件：储存于-20℃ ，避免反复冻融 使用浓度：一般为5%～20%，常为10% 合成培养基 无机盐 基本组分： 氨基酸：12种必需氨基酸 维生素 碳水化合物：葡萄糖 （酚红） 1951年,Earle——Earle基础合成培养基MEM (minimum essential media) 合成培养基常见种类: MEM DMEM(Dulbecco’s modified Earle medium) RPMI 1640 199,109培养基 HamF10, HamF12——适合于单个细胞分离培养 McCoy’s 5A——适合于原代细胞培养，适合于较难培