高效液相色谱法原理及其应用讲课资料.pptVIP

高效液相色谱法（HPLC）;第一节 高效液相色谱法基本原理;二、与气相色谱法比较 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包 括有机介质溶液），不受样品挥发性 和热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生???样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80% ;2．流动相的区别 GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作 用力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作 用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对 分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余 地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到 调控作用，当选用不同比例的两种或两种以 上液体作为流动相也可以增大分离选择性。 ;3．操作条件区别 GC：加温操作（※对气相色谱分离效率最有影响的因素） HPLC：室温；高压 ;三、高效液相色谱法的特点;（二）高效液相色谱法的分类及分离机制; 按流动相与固定相极性的相对强弱分类： 正相色谱法、反相色谱法 ;一、※液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂 分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异 调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱;二、※液液分配色谱法（LLC）;※反相色谱——固定相极性 流动相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。 通常对于亲水固定液采用 疏水性 流动相 ;三、离子交换色谱法（IEC）;四、空间排斥色谱法（SEC）;五、亲合色谱法（AC）;六、化学键合相色谱法（BPC）;按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较;（四）高效液相色谱法的定性定量分析方法;第二节 高效液相色谱仪;;※（一）输液系统 一、储液装置：过滤器 二、脱气装置：脱气机 流动相脱气： （1）吹氦脱气法 （2）加热回流法 （3）抽真空脱气法 （4）超声波脱气法 （5）在线真空脱气法;;流动相（淋洗剂、洗脱剂）是影响液相色谱分离的一个非常重要的实验因素。改变流动相的性质和组成将改变溶质组分的保留值、分离选择性和柱效。在实际工作中，流动相的可选择范围较大是液相色谱的一个显著特点。;※液相色谱中,?组分的保留值大小决定于组分与流动相和固定相分子间作用力：比如吸附、分配、离子交换、亲和力等。;※（二）高压输液泵及梯度洗脱装置;往复柱塞泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动，保证将流动相以稳定的速度流过色谱柱的部件。;2．恒压泵：恒压泵又称气动放大泵，是输出恒定压力的泵。;;避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。 例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物， 四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混 合物等。;二、高压输液泵的基本要求： 1. 流量范围宽 2. 重现性和准确度好 3. 输出的流动相无脉冲影响 4. 输出压力高且耐压 5. 密封性能好 6. 具备压力检测和保护功能;三、高压输液泵的性能参数;四、梯度洗脱装置;※梯度洗脱的原理： 流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k，并使样品中的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。 ;※梯度洗脱的优点： 1.缩短分析周期； 2.提高分离能力； 3.峰型得到改善，减少拖尾； 4.增加灵敏度。但有时引起基线漂移。;※（三）进样装置 ;进样阀的基本要求： 1. 耐高压 2. 进样量准确 3. 进样重复性好 4. 无流量和压力波动影响;进样阀的保护措施： 1. 在泵和进样阀之间安装在线过滤器，防止机械杂质进入进样阀。 2. 以缓冲液作流动相时，定期用水清洗进样阀，尤其是在色谱仪关机前。;自动进样器的组成部分： 1. 进样阀 2. 样品环管 3. 进样针头 4. 样品瓶 5. 支架 ;※（四） 色谱柱 ;色谱柱的要求： ※柱效高：通过减小填料粒度来提高柱效 ※选择性好：可通过改变固定相的种类和流动相的种类来改变色谱柱的选择性。 分析速度快;一、柱材料及规格 1．柱材料：色谱柱由