原位杂交溶液.docVIP

原位杂交试剂和溶液 ⑴ PBS(pH 7.4)：140 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4 , 1.8 mM KH2PO4 ( Boehringer Mannheim in situ manual, Page 128 ) 10×PBS 1000ml 配方： NaCI 81.8 g KCI 2.0 g Na2HPO4?7H2O 26.81 g KH2PO4 2.45 g 800mlddH2O溶解后pH 值6.8，用10N NaOH 调整至pH 7.4。定容，过滤，DEPC处理，高压灭菌。室温保存。 ⑵ 4% 多聚甲醛：300 ml配方 10×PBS 30 ml DEPC-H2O 270 ml 固体NaOH 0.18 g Triton X-100 300μl （ 终浓度为0.1%，可选项） 三角瓶中加入300 ml的 1×PBS，然后置天平上称取固体NaOH，摇动溶解，微波炉加热（600W, 2分钟，一般为60℃）。三角瓶复置于天平上称取多聚甲醛12 g，加入300μl triton（可选），封口，摇至清澈*，冰上冷却至室温，加浓硫酸约40μl 调pH至7.0，分装在50 ml三角瓶中，-20℃保存。（只能冻融一次）。* 注意：如要加入triton，须用磁力棒搅匀。 ⑶ 1 M Tris （pH 7.5） 200 ml 配方（用于配制蛋白酶K buffer和 杂交液A）。 用高温烘烤过的瓶、量筒、不锈钢药勺、DEPC处理的 枪头。 Tris base 24.23 g DEPC-H2O 160 ml 浓HCI 14.5 ml PH试纸测pH值（约为7.5），用DEPC-H2O定容，高温灭菌，室温保存。 ⑷ 0.5 M EDTA（pH 7.5） 200 ml 配方（用于配制杂交前的蛋白酶 K buffer和杂交液A） EDTANa2?2H2O 37.22 g ddH2O 160 ml NaOH 4 g 加热，磁力搅拌至彻底溶解，冷却至室温，PH试纸测pH值（应为7.2-7.5，按7.5 用），定容，DEPC处理，高温灭菌，室温保存。 ⑸ 蛋白酶K buffer （pH 7.5）：（ 用高温烘烤过的器皿） 100mM Tris-HCI (pH 7.5) 50mM EDTA (pH 7.5) 200 ml 配方：1M Tris-HCI (pH 7.5) 20 ml 0.5M EDTA (pH 7.5) 20 ml DEPC-H2O 160 ml 以下⑥⑦⑧用于配制杂交液A，故⑥⑧用量少，而⑦可用于探针半定量。 ⑹ ⑹ 50% dextran sulfate：1 ml DEPC?H2O 500μl dextran sulfate 0.5 g 先将500μl DEPC?H2O加入1.5 ml离心管中，后加入0.5 g dextran sulfate。沸水浴至溶解约?时，4000 rpm 离心数秒，继续沸水浴至几乎全溶，颠倒混合（加速管底部分的溶解），4000 rpm 离心数秒，继续沸水浴至全溶，4000 rpm 离心数秒，冷却至室温，加DEPC?H2O 270μl，总体积正好1000μl。颠倒混合，继续温浴（约90℃）5 min，旋涡震荡，稍微离心，-20℃保存。 如果配制更大体积的（如10 ml），可用1个10 ml的血清瓶（180℃烘烤7小时，瓶盖用DEPC处理），先称取5 g dextran sulfate，后加5ml DEPC-H2O，小磁力棒搅拌，沸水浴5 min；重复几次，直至全溶。最后加2.7 ml DEPC-H2O，搅匀后分装（每管1ml），-20℃保存。 ⑺ ⑺ 马