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SSR分子标记实验操作及其注意事项 SSR(Simple Sequence Repeats ) 又称微卫星DNA，是一类由几个(多为1~6个) 碱基组成的基序(motif )串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于整个基因组的不同位置上，每个座位上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，而且分布均匀，多态性高，呈共显性遗传，重复性好，操作简便，是一种理想的分子标记技术，被广泛应用于构建基因连锁图分子辅助育种品种鉴定遗传资源的保存等方面。 一、试剂配制 1.0.2%亲水binding silence（现配现用）：1500μL95%乙醇，7.5μL冰醋酸，再加入3μLbinding silence，混匀后使用。 2.0.5%疏水repel silence（购买后可直接使用） 3.TBE母液（5×TBE）：Tris Base,54g;硼酸,7.5g;EDTA(0.5M pH8.0),20ml.搅拌溶化，定容至1000ml，无需灭菌，室温保存，母液的pH值应保持在8.3左右。 4.Urea－TBE(一块胶板用量)： 5×TBE,12ml;尿素,27g.加双蒸水溶解后定容至51ml，使用漏斗过滤。 5.40％丙烯酰胺：丙烯酰胺,380g;甲叉双丙烯酰胺,20g.加热至37℃使之溶解，加水定容至1000ml，用醋酸纤维素滤膜（入Nalge滤器，0.45μm孔径）过滤，棕色瓶避光保存于室温。 6.10％APS（过硫酸铵）：超纯过硫酸铵,2g;超纯水,18ml.溶解后，4℃保存。 7.TEMED（购买后可直接使用）：电泳级的TEMED可购自Bio-Rad，Sigma或其他供应商。 8.Loading buffer：去离子甲酰胺,50ml;0.5MEDTA(pH8.0),1ml;二甲苯腈蓝cyanol,0.125g;溴酚蓝,0.125g.混匀后置于4℃保存。 9.固定液：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸的固定液。 10.染色溶液(ACS 试剂)：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml，AgNO3 1g。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3的染色液。 11.显影溶液：15g NaOH，0.5ml 甲醛，水500ml。终浓度为3％NaOH，0.1%甲醛。 二：DNA提取过程中的注意事项 (1) 避免试验材料间DNA的交叉污染或外来DNA的污染。使用冷冻干燥叶片法，可以将每个样品在单独的离心管中研磨，研磨使用的小钢珠球最好是一次性的，如果是反复使用的小钢珠球，必须彻底清洗干净使用液氮和研钵研磨叶片组织时，必须在每次研磨前彻底清理干净研钵和研磨棒。 (2) 试验材料应选取幼嫩组织，因为植物幼嫩组织DNA含量高，且多糖多酚含量少。 (3) 装入离心管的叶片组织最好不要超过离心管的1/3-1/2，否则会引起细胞裂解不完全，导致产量和纯度下降。 (4) 使用液氮研磨时，要先将研钵用液氮冷却，在加入液氮后，要先将叶片压碎，研磨时要快速用力，尽量使样品磨成粉末状。 (5) 水浴前需要确保试管盖盖严，或使用辅助工具进行加固，以防止水浴时因温度较高导致试管盖开裂。 (6) 水浴过程中，每隔10-15min将离心管取出振荡摇匀，使粉碎的叶片组织尽量与裂解液充分接触，破坏细胞结构，释放DNA。 (7) 实验过程中振荡动作不宜剧烈，移液枪头最好使用大孔枪头，移液动作不能太快，以免使DNA断裂。 (8) 当DNA以小球状固体沉积在离心管底部后，倾倒离心管中多余液体时，应避免把DNA小球一起倒出 可在倒去大部分液体后，改用吸水纸吸取剩余液体。 (9) DNA风干最好在无菌操作台上进行，待乙醇彻底风干后才能加入TE或ddH2O溶解，如果有残留的乙醇，可能会影响PCR反应的试验结果。 (10) 如果DNA纯度不好，可将粗提物用溶液1×TE充分溶解，离心后，取上清液再次沉淀DNA，可有效除去多糖。 三：实验步骤 1、玻璃板清洗： 1）用洗涤剂把玻璃反复擦洗干净，用酒精擦干、干燥。在疏水玻璃板上均匀涂上300-500μL的0.5%的疏水剂Binding Silane。可放置过夜。 2）配制凝胶前，在亲水玻璃板上均匀涂上2％的亲水剂Repel Silane，保证玻璃板的每个地方都涂上亲水剂，晾干至少5min，然后用酒精轻轻擦拭以去掉多余的亲水剂。 3）玻璃板彻底干燥后进行玻璃板组装。两块玻璃板两边边缘割伤配套的硬纸条，橡皮夹子夹住两边，在橡皮夹子里加上硬纸片可以保证玻璃板的水平，可以有效地防止条带跑歪。下边套上有旋钮的塑料套，旋紧旋钮，以防止底下漏胶在插入梳子的位置插入一个硬纸条以保证上方