荧光定量引物自动化设计教程(1).doc

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2019-09-09 发布于湖北
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荧光定量引物自动化设计教程(1).doc

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荧光定量引物设计原则：扩增产物75-200bp，片段越短扩增效率越高，；但是片段太短，扩增产物与引物二聚体无法区分。扩增产物避免出现二级结构。模板避免有长的单碱基重复。 GC含量为50%-60%，溶解温度在50℃-65℃之间。引物避免产生二级结构，避免超过3个G或C重复，引物末端碱基为G或C。引物之间不会产生二聚体，引物跨内含子。由于定量引物设计要求条件较高，人工设计需要熟悉多个软件的操作，因此现在我们利用网站来自动化设计定量引物。引物设计网站网址为： /Scitools/Applications/RealTimePCR/ 在这里以拟南芥基因At3g57280为例，设计方法如下：从NCBI中下载目标基因的基因组序列（一定要是包含内含子的基因组序列）。在word中标注内含子和外显子，内含子用小写字母，外显子用大写字母。格式如下 At3g57280 ttcgttttttctcatctccgatccctaaagtcaaagattaaaccacactaaaccgaaattgtcatatgcgcgtaatttcttcgcaacattttgaccgaacaacttcaaaatcaaacgagcggacggtcaagattgtccgatcagtatcgtctttttagtcagtcagtcctgaacgccggctagatcaaccactccatctctcgtgctgaccacgctccgattctccatttctttcccttttgacttttcacttccaatttttcggtatcagatctggacgATGGCTTCACAAATCTCTCAGCTTGCTTGTTTCTCATCCACCAATCGCCAATTTCACTTCCAAAGCCGATCGTTTCCATGCCCTATGATTCGTCCCCAGgtaaatatctcgatatcgcatgaaaaagacttggaatttactcatctcgattagattacgtccatgcccaatactctatttgttctacttttcctgattactctcaaaaacgtttgagcttgattgatttagtcgtaatcgaatatttgcttttgttttctagaaatggttctccttgagacttgaattgcttctctgttttctctggttgagttggttgggaatgtaccatgtcttcaataacaaaaattgcctttttgttcacctttttgattgtctctatgtgctaattatcatatgttgagctctcttctaaattttttgggattgatagtgtctccactagtggcttattggctataaattggttcagTCTTTTGTAGTTAAAAGTGTTGATGGGAATAGCTCTGAAACACCAGCTTCTCTAAGCTATACAGCTGAGGTTTCAAAACCTGTTGTTGAGAAAACATCCAAACCGTATTCCACTGTTGATGAAACTGCTACCAATAAAGAGAGCATCACAGAGCCAGTAGAGGAAGATGTTGCCACACAACCAATAAGAGCAGCAAAGATCCACGACTTCTGTTTCGGCATTCCTTATGgtactactttgtgactctcaaactttctttcaaatcttagcatttctagcaaagagttgcttattgtcaggtaacacgctggtgttaataaatgatactttttcagGTGGTCTCGTTGTGAGTGGAGGGCTTCTTGGTTTTGCGTTTTCACGAAATCTTACAAGTTTAAGTACTGGTGTCCTCTATGGTGGTGGCCTTCTAGCCCTTAGTACACTGAGCTTAAAGATTTGGCGAGAGGGAAAATCTAGTTTCCCTTATATACTAGGACAAGCAGgtaatcttcatttattgtctgcaggaacagtaggggatattttgttaccacgactttttttcatctctaattcattacatcaagtaattactggtatcttactcatgataagtggatattaaaatcgagataagtatactgtgtcatgctatgaagtggtcatctctgaacattatgtgcctatgattctctataagaaatgttcattttatctatgaaagcatttgtgcttactcatttttctaaacctgaaattgcagTGCTTTCAGCTGTCGTCTTCTGGAAGAACTTCACAGCTTATTCGATGgtattcattatctttgtgatcatgctgattgtttatttttgcttgcttg