HPLC方法开发——流动相的选择学习课件演示课件.pptVIP

3. 过滤 溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 * .. 4. 脱气 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min。 在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气。 * .. 5. 溶剂过滤器的防护 溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。 （1）严格执行溶剂过滤 （2）勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液 （3）避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。 堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%）中浸泡1h，然后用蒸馏水冲洗干净。 * .. 6．流动相的贮存 流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器内，不要贮存在塑料容器中。 贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧及尘埃溶入流动相。 磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存超过规定的有效期。 容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。 * .. 7．HPLC实验用水 HPLC实验用水除满足药典对纯化水 一般要求外，还需要满足以下要求： 项目 指标 电阻率，MΩ·cm，25℃，最小 18.0 总有机碳（TOC)，mg/L，最大 0.5 微粒，μm滤器 0.22 HPLC级水增加紫外加吸收要求： 在1cm池中，用HPLC级水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分别不得过0.01、0.01和0.05。 * .. 8. 等度洗脱 在反相色谱中，极性越强的溶剂洗脱能力越弱。 等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，组分极性有一定差别的样品，多用于含量测定。 优点：基线平稳，保留时间重现性好，对流动相纯度要求低。 缺点：较早洗脱出的色谱峰时分离度差，较晚洗脱出的色谱峰展宽理论塔板数低。 * .. 9. 梯度洗脱 梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多样品。 优点： 缩短分析时间 提高分离度 改善峰形 提高检测灵敏度 缺点： 增加基线漂移 较长平衡时间 * .. 9. 梯度洗脱 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视： 要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高 混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化 。要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。 每次梯度洗脱之后必须10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使其恢复到初始状态。 * .. 10．流动相的pH值 反相离子抑制技术： 采用反相色谱法分离弱酸或弱碱样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术。 对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的解离平衡常数Ka值越小，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在； 对弱碱，流动相的pH值越大，组分的Ka值越大，当pH值远远大于弱碱的pKa值时，弱碱主要以分子形式存在； 分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用10～50mmol/L磷酸盐缓冲液，0.05%TFA ； 分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用10mmol/L三乙胺溶液， 0.05~0.5%NH4OH。 * .. 10．流动相的pH值 当溶液pH值等于化合物的pKa时，化合物半解离。 在pKa±1.5的范围内，保留随pH值的变化而发生明显变化。 超过此pH值范围，化合物完全解离或不解离，保留随pH值的变化很小。 了解化合物的pKa值，可在pKa±2的范围外调节流动相的pH值，使化合物有较好的峰形，保持保留的恒定，使建立的方法具有耐用性。  * .. 10．流动相的pH值