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基于Gateway 体系一步PCR 法构建CRISPR 终载体 准备： Template 3 ng/uL (U3:PJF998 EcoRV 酶切回收；U6:PJF999 EcoRV 酶切回收) OJP001/OJP002 混合工作液 10uM Spacer-F/R 混合工作液 1uM 1. PCR 扩增 将OJP001/002 和靶点正反向引物同时加入反应体系中 植 Template Mix OJP001/002 Spacer-F/R KOD-FX ddH2O 物 0.2 uL 7 uL 0.6 uL 0.4 uL 0.2 uL 1.6 uL 仅 PCR 反应程序： 限 科 94℃ 2’ →( 98℃ 10’’ → 55℃ 20’’ → 68℃ 1’) X 45 cycles → 68℃ 5’ →25 ℃ 自 学 2. LR 反应 最 PCR 产物 （0.4uL ）与PJE045 做LR 反应 （可以做1uL 体系）3h 以上，电转（热 激转化）。用 前 3. 菌落PCR ，不 沿 U3-temp: OJP008 OJP026 做菌落PCR （411 bp ），提质粒、OJP026 测序。 微 U6a-temp: OJF320 OJP026 做菌落PCR （800 bp ），提质粒、OJP026 测序。 准 信 4.引物信息 商 公 OJP001 tcgcgttaacgctagcatggatctc 用 OJP002 gtaacatcagagattttgagacac 众 OJP026 TGCACATACAAATGGACGAA 号 OJP008 ACCACCTCGGCTATCCACA 粉 OJF320 catccactccaagctcttg U3-Spacer-F-3’adapter ANNNNNNNNNNNgttttagagctatgctgaaa 丝 U3-Spacer-R-3’adapter NNNNNNNNNNNTtgccacggatcatctgcac 提 U6-Spacer-F-3’adapter GNNNNNNNNNNNgttttagagctagaaatag 供 U6-Spacer-R-3’adapter NNNNNNNNNNNCggcagccaagccagcaccc 5.质粒图谱 ojd405 F OsU3J OJF320 OJP008 U3 F sgRNA OJP002 Eco RV (3508) OJP002