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第三章 酶与细胞的固定化 固定化生物技术——通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其 保持活性并可反复利用。经固定化的酶既具有酶的催化性质，又具有一般化学催化剂能回收、 反复利用的优点，并在生产工艺上实现连续化、自动化。 游离酶的缺点： 1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。 2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。 3.分离纯化困难。 活性污泥法可以看成是包埋固定化生物技术的雏形。在活性污泥中，所有微生物几乎是全部 被包裹（或包埋）在微生物絮体内，自然形成的微生物絮体（活性污泥）可认为是一种最原 始的包埋固定化微生物。这种方法形成的微生物絮体的特点是靠自然形成，解体容易。即固 定化强度不高，常发生污泥膨胀。 20世纪50、60年代初下了高效生物膜法。该方法是依靠微生物的自然附着力在某些固形物 的表面形成固着型生物膜，如生物固定床、生物流化床、生物接触氧化法等工艺。这种生物 膜固定化强度虽比上述的生物絮体高，但仍然没有摆脱自然的力量。 第一节 酶与细胞的固定化 一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点 1. 固定化酶(immobilized enzyme) 固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。 什么是固定化酶？ 优点： (1)可提高稳定性。 (2)能回收，易与产物分离，可反复使用。 缺点： (1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。 (2)酶活性下降。 固定化细胞（immobilized cell） 固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。在固定 化酶基础上，于70 年代后期发展起来的新技术，应用超过了固定化酶。 优越性： (1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用。 3.固定化原生质体 MC 和PC 除去细胞壁后可获得原生质体。 意义：(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高。 二、固定化方法 （一）酶的固定化方法包括：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法，其中吸附法又包括物 理吸附法和离子交换吸附法，包埋法包括网格型和微囊型。 1.吸附法（adsorption） 依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体 的表面或离子交换剂上。根据吸附剂的特点分: 1）物理吸附法（physicaladsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。 2）离子结合法（ion binding） 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素 优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。 缺点：结合力弱，易解吸附。 2.共价偶联法（covalent binding orcovalent coupling） 即用化学法将载体活化，再与酶上基团反应形成共价键，从而将酶结合于载体上。借助共价 键将酶的 1）载体：亲水载体优于疏水载体 如: 天然高分子衍生物：纤维素、葡聚糖凝胶 、琼脂糖 ，亲和性好，机械性能差 合成聚合物：聚丙烯酰胺、苯乙烯、尼龙 机械性能好，但有疏水结构。 2）偶联方法： 活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。 常用的偶联反应有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。 优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。 缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。 3.交联法（crosslinking） 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。 双功能试剂常用的是戊二醛。戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶 蛋白交联。 此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：交联法不使用载体。 交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。 • 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态 缺点： (1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。 (2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。 4．包埋法 将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。分为： 网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。 1